脓毒症是指复杂的全身感染引起的炎症反应综合征。由于高发病率、病死率和高住院费用，脓毒症越来越受到重视^[1]。脓毒症心肌病（SIC）是指脓毒症患者产生严重的心功能损害，表现为血压降低；左室射血分数和短轴缩短率降低；难治性心力衰竭和收缩舒张功能障碍；是ICU患者并发症与高病死率的原因之一^[2]。SIC的发病机制涉及线粒体功能紊乱，钙调节，氧化应激，炎性细胞因子失调，自主神经系统紊乱、内皮细胞失调等。其中心肌细胞损伤与凋亡是其中的重要因素^[3]。近年来，随着心功能监测技术，特别是床边超声心动图的广泛应用，人们对SIC有了新的认识。然而，SIC的具体机制尚未完全阐明，针对其特异性治疗方法缺乏造成SIC患者病死率高，恢复后心脏后遗症发生率高^[4]。因此寻找特异性治疗方法迫在眉睫。

Kruppel样因子4（KLF4）是一种转录因子。Hartmann等发现KLF4可以抑制动脉粥样硬化，减少血管损伤。Zhang等^[6]发现KLF4能够减轻小鼠心肌梗死损伤，改善心功能。提示KLF4在心血管疾病中的保护作用。然而其是否能够保护脂多糖诱导的心肌细胞损伤，国内外尚无报道。本研究旨在探讨KLF4在脂多糖诱导的心肌细胞损伤中的作用和机制。

1~3 d SD大鼠乳鼠（购买于北京华富康生物有限公司，SPF级）在75%酒精中浸泡后用剪刀剪开胸腔取出心脏，剪去心房和右心室，将左心室置于预冷的D-hans液体中清洗，用剪刀将其快速剪成1 mm³的小块，采用0.25%胰酶进行消化8 min，消化5次待心脏完全消化完毕，收集消化液，快速离心后收集细胞沉淀，采用含有15%胎牛血清的DMEM-F12（购买于Gbico公司，美国）进行重悬，采用滤器过滤细胞团块，将细胞种植于培养皿中，采用差时贴壁法去除成纤维细胞，获得的心肌细胞采用α-actin染色鉴定。心肌细胞培养于15%胎牛血清的DMEM-F12中进行处理。

随机（随机数字法）将细胞分为5组：①空白组；② NC组（Negative Control腺病毒转染心肌细胞组）；③ NC+LPS组（Negative Control腺病毒转染心肌细胞+10 μg/mL LPS处理24 h）；④ KLF4过表达组（转染腺病毒过表达KLF4 8h）；⑤ KLF4过表达+LPS组（KLF4腺病毒转染心肌细胞+10 μg/mL LPS处理24 h）。腺病毒过表达KLF4载体由山东维真生物提供。

将细胞种植于96孔板内，处理后每孔20 μL MTT溶液（5 mg/mL）孵育4 h，终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490 nm处测量各孔的吸光值。每组细胞活性（%）=（OD处理-OD对照）×100%/OD对照。

细胞接种于6孔板中，处理后收集细胞上清液和细胞，采用裂解液裂解细胞，提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，采用TNFa、IL-1β和IL-6 Elisa试剂盒（购买于Biolegends公司，美国）进行炎症因子检测，采用标准品绘制标准曲线，在酶标仪（Bio-Tech公司，美国）下检测各种TNFa、IL-1β和IL-6的浓度。

采用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，各组细胞接种于96孔板用于酶标仪检测。处理后的细胞每孔加入1 μL的DCFH-DA（碧云天，上海），孵育20 min后采用培养基洗涤3次，酶标仪下检测荧光量度。采用碧云天试剂盒检测MDA的含量，SOD2和Gpx的活性。搜集细胞，常规裂解后采用BCA法检测蛋白浓度，根据试剂盒步骤分别检测MDA的含量，SOD2和Gpx的活性。在酶标仪（Bio-Tech公司，美国）下检测各指标吸光度的大小。

细胞接种于24孔板，采用Tunel染色试剂盒进行凋亡检测（Millipore公司，美国）。细胞采用4%多聚甲醛固定5 min，采用TritolX100进行通透，采用TdT酶工作液孵育1 h，采用Anti-Digoxigenin荧光工作液孵育0.5 h，采用DAPI进行细胞核染色封片，在显微镜下观察。

提取细胞总蛋白和核蛋白（碧云天核蛋白提取试剂盒），用细胞刮子刮下细胞，每20 μL细胞沉淀加入200 μL添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。最高速剧烈震荡5 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。冰浴10~15 min加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10 μL。最高速剧烈震荡5 s，冰浴1 min。4℃ 12 000~16 000g离心5 min。吸取上清液至预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。最高速剧烈震荡15~30 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1~2 min再高速剧烈震荡15~30 s，共30 min。4℃ 12 000~16 000g离心10 min。立即吸取上清液至预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。-70℃冻存。

采用SDS-PAGE检测电泳，将蛋白转移至PVDF膜，以抗KLF4、TLR4和NRF2抗体（Abcam公司，美国）孵育过夜，二抗孵育后采用DAB二抗显色系统进行显色反应。以GAPDH蛋白（Abcam公司，美国）作为总蛋白内参，以组蛋白H3（Abcam公司，美国）作为核蛋白内参。

采用SPSS23.0软件进行分析，计量资料以以均数±标准差（Mean±SD）表示，两组间差异以独立样本t检验进行分析，多组间比较采用单因素方差分析进行统计分析，事后检验采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用KLF4腺病毒转染心肌细胞8 h，随后换含15%胎牛血清的DEME-F12培养基培养24 h。蛋白印迹结果显示与NC组相比，LPS组细胞KLF4的表达明显降低（P＜0.05），KLF4过表达组心肌细胞KLF4表达高于NC组（P＜0.01）。KLF4+LPS组细胞KLF4的蛋白表达高于NC+LPS组（P＜0.001）（图 1）。

与NC组相比, aP＜0.05；与NC+LPS组相比, bP＜0.05（n=6） 图 1 心肌细胞腺病毒过表达KLF4 Fig 1 Over-expression of KLF4 in cardiomyocytes

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采用MTT检测细胞活性，在各组处理12 h，24 h和48 h后，NC+LPS组心肌细胞活性明显低于空白组和NC组（P＜0.01），而KLF4过表达组心肌细胞活性与NC组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；KLF4+LPS组细胞处理12 h，24 h和48 h后细胞活性则均高于NC+LPS组（P＜0.001）（图 2）。

与NC组相比, aP＜0.05；与NC+LPS组相比, bP＜0.05（n=6） 图 2 KLF4过表达增加细胞活性 Fig 2 KLF4 overexpression increases cell viability

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采用ELISA检测心肌细胞TNFa，IL-1β和IL-6的水平，结果显示：NC+LPS组心肌细胞TNFa，IL-1β和IL-6的水平明显高于NC组（P＜0.0001），而KLF4过表达组心肌细胞TNFa，IL-1β和IL-6的水平与NC组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；KLF4过表达+LPS组心肌细胞上述炎症因子的水平低于NC+LPS组（P＜0.0001）（表 1）。

采用试剂盒检测心肌细胞氧化应激水平，结果显示：NC+LPS组心肌细胞ROS水平和MDA水平明显高于NC组，而SOD2以及Gpx活性明显低于NC组（P＜0.0001）；KLF4过表达组心肌细胞上述指标与NC组差异无统计学意义（P＞0.05）；KLF4过表达+LPS组心肌细胞ROS水平和MDA水平均低于NC+LPS组（P＜0.0001），而SOD2以及Gpx活性明显高于NC+LPS组（P＜0.0001）（表 2）。

采用Tunel染色检测各组心肌细胞凋亡数量，结果显示：NC+LPS组心肌细胞凋亡数量高于NC组（P＜0.001），而KLF4过表达组心肌细胞凋亡数量与NC组差异无统计学意义（P＞0.05）；KLF4过表达+LPS组心肌细胞凋亡数量低于NC+LPS组（P＜0.0001）（图 3）。

绿色表示凋亡细胞，蓝色表示细胞核；放大倍数200倍。与NC组相比,aP＜0.05；与NC+LPS组相比,bP＜0.05 图 3 KLF4过表达减轻LPS诱导的心肌细胞凋亡（n=6） Fig 3 Overexpression of KLF4 attenuates cardiomyocyte apoptosis induced by LPS

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采用蛋白印迹检测相关信号分子的表达，结果显示与NC组相比，NC+LPS组心肌细胞TLR4总蛋白的水平明显增高，心肌细胞核中NRF2的蛋白水平明显低于NC组；而KLF4过表达+LPS组心肌细胞TLR4总蛋白水平明显低于NC+LPS组，心肌细胞核中NRF2的蛋白水平明显高于NC+LPS组（P＜0.001）（图 4）。

与NC组相比, aP＜0.05；与NC+LPS组相比, bP＜0.05（n=6） 图 4 KLF4过表达对TLR4和NRF2的影响 Fig 4 Effect of overexpression of KLF4 on TLR4 and NRF2

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越来越多的证据表明KLF4在心血管疾病中发挥重要作用。本研究目的是探索KLF4在脓毒症心肌病中的作用及其潜在机制。我们发现在心肌细胞中过表达KLF4蛋白后，LPS刺激下，原代大鼠心肌细胞活性增加、炎症介质的释放以及心肌细胞氧化应激明显降低；此外心肌细胞凋亡数量明显减少。提示KLF4可作为一种保护性的因子保护心肌细胞免受脓毒症损伤。

研究发现炎症细胞因子，特别是IL-1β、IL-6和TNFα是SIC形成的主要因素^[7]。已经证明当内毒素如脂多糖结合心肌细胞和巨噬细胞膜表面受体TLR4后可活化NF-κB活化导致NF-κB移位进入细胞核^[8]。在受到脂多糖的刺激后巨噬细胞和心肌细胞可以释放大量的炎症介质，如巨噬细胞趋化因子、集落刺激因子、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8和TNFa^{[2, 7, 9]}。这些炎性细胞因子可以引起心肌细胞钙稳态失衡，能量代谢紊乱，损伤肾上腺素能信号和一氧化氮信号，导致心肌收缩力下降、舒张功能不全^[10]。本研究发现KLF4过表达能够明显减少LPS刺激后心肌细胞TNFa、IL-1β、IL-6的释放，保护心肌细胞的进一步损伤，减少细胞凋亡。TLR4是病原相关模式识别受体之一，在内毒素LPS刺激下，TLR4识别LPS随之传导炎症信号至胞内，促进细胞的炎症反应。以往的研究发现KLF4在维持内皮完整性方面发挥重要作用^[11]。损害KLF4的作用可诱发肺动脉高压^[12]。近期LiW等人发现在脓毒症小鼠模型中，巨噬细胞TLR4通过下游的ERK1/2诱导KLF4的泛素化降解，从而发挥促炎症作用^[13]。然而本研究首次发现KLF4能抑制心肌细胞TLR4的表达，从而减少LPS诱导的炎症损伤。本研究也发现在LPS刺激下，心肌细胞KLF4的表达降低。这些证据提示TLR4与KLF4可以发挥相互负向调控作用。

在生理状态下，活性氧是维持细胞稳态不可或缺的第二信使，然而在病理刺激状态下，ROS的过度合成以及抗氧化剂的合成不足，导致细胞内氧化还原平衡失调^[14]。当过度产生的ROS不能及时抵消时，细胞发生氧化应激。氧化应激引起蛋白质、DNA和脂质的破坏^[15]。研究已中证实氧化应激在多种心血管疾病中发挥作用包括心衰、高血压、心肌纤维化和心肌肥大，以及脓毒症心肌病。以往的研究发现KLF4在胶质母细胞瘤中改善氧化应激^[16]。Xu等^[17]也发现KLF4参与滤泡性颗粒细胞的氧化应激损伤。本研究也发现KLF4减少LPS诱导的心肌细胞氧化应激损伤，同时也为首次发现KLF4能增加心肌细胞NRF2的细胞核表达。NRF2是一种转录因子，参与调控细胞的氧化还原反应，其可以直接结合到多种抗氧化酶的DNA内含子区域，促进抗氧化酶的转录（包括SOD2，Gpx以及过氧化氢酶等）^[18]。正常情况下，NRF2在细胞浆内与keap1结合，当细胞氧化物增加时，keap1的半胱氨酸残基被氧化或共价修饰，NRF2释放到细胞核发挥功能^[19]。NRF2在受多种信号分子的调控如PI3K/AKT，NOTCH以及MAPK^[19]。KLF4调控NRF2核表达的机制尚待厘清，KLF4可能通过调控NRF2的转录，或参与keap1与NRF2的解离，促进其向细胞核转位，从而增加抗氧化酶的转录。

综述所述，KLF4能够保护内毒素LPS诱导的心肌细胞损伤，KLF4通过抑制TLR4的表达，增加NRF2的表达抑制心肌细胞炎症损伤和氧化应激损伤，从而减少细胞凋亡。KLF4可能成为治疗脓毒症心肌病的新靶点。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突