2016年提出的脓毒症-3定义为宿主对感染的反应失调，产生危及生命的器官功能损害^[1]。脓毒症早期表现为过度促炎反应，后期逐渐演变为免疫抑制，导致免疫细胞过度凋亡^[2]。脾脏含有大量淋巴细胞及巨噬细胞，是机体细胞免疫及体液免疫的中心。脓毒症的免疫抑制机制，包括淋巴细胞功能障碍和凋亡^[3]。因此有效调控淋巴细胞凋亡治疗已成为治疗脓毒症的研究热点之一。脓毒症发生发展中作为最强抗原呈递细胞的树突细胞（dendritic cells DCs）也存在凋亡及其表面分子的改变^[4]。临床研究提示脓毒症患者体内DCs总量明显降低^[5]。因此减少DCs凋亡也可能成为临床上治疗脓毒症的靶点之一。胍丁胺（AGM）作为L-精氨酸脱羧后生成的一种内源性阳离子聚胺，在脓毒症动物实验中被证实对重要器官有保护效应^[6-8]。有研究发现胍丁胺可通过增强创伤后刀豆蛋白A刺激脾细胞增殖明显改善创伤诱导小鼠脾细胞的免疫功能抑制^[9]。胍丁胺可否在调控脓毒症机体免疫功能抑制的同时抑制脾淋巴细胞及DCs的凋亡？本研究通过建立内毒素诱导的脓毒症大鼠模型，探讨胍丁胺对脓毒症大鼠脾细胞与DCs凋亡的影响。

健康清洁级雄性大鼠90只，体质量180~220 g，购自第三军医大学，证书编号为SCXK(渝) 2012-0005。LPS、胍丁胺均购自美国Sigma公司；Anti-Rat CD11b/c PE购自美国eBioscience公司；7-AAD Staining solution、Annexin V购自美国BD公司。

将90只大鼠按随机数字表法分为三组：对照组、内毒素组、胍丁胺组，每组30只；股静脉注射LPS（10 mg/kg）制备内毒素组大鼠模型，对照组经股静脉注射等量生理盐水，胍丁胺组经股静脉注射LPS（10 mg/kg）和腹腔注射胍丁胺（200 mg/kg）。各组分别于建模后0 h、12 h、24 h随机麻醉处死10只大鼠（标记为0 h、12 h、24 h亚组），留取脾脏标本备检。

实验室微量电子秤重复测量脾脏组织重量，并计数，以g表示，精确到小数点后四位。

室温下梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋，组织切片。常规脱蜡后HE染色，显微镜下观察脾脏组织的形态。

（1）FCM检测脾细胞总凋亡率：取脾脏标本浸泡PBS清洗及筛网研磨，加入红细胞裂解液后孵育，离心后去上清液，将细胞悬浮液分装至2个离心管中：一管作对照，另一管孵育抗体；孵育抗体的一管，分别加入Annexin V 5 μL；7-AAD Staining solution 5 μL，室温孵育15 min；标记抗体的每管细胞再加入400 μL Banding Bufferx稀释，上机检测。（2）FCM检测DCs数量及凋亡率：同上述实验步骤；孵育抗体的一管，分别加入Anti-Rat CD11b/c PE 2.5 μL，Annexin V 5μL；7-AAD Staining solution 5 μL，室温孵育15 min；标记抗体的每管细胞再加入400 μL Banding Bufferx稀释，上机检测。

计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，运用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用方差分析LSD-t检验进行分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

与对照组的12 h、24 h亚组相比较，内毒素组对应亚组的大鼠脾脏重量均明显升高；与内毒素组的12 h、24 h亚组相比较，胍丁胺组对应亚组的大鼠脾脏重量均明显下降（P < 0.05）。见表 1。

对照组可见大小不一的脾血窦腔隙，血窦之间为脾索，脾索互相通连成网，含红细胞较多，淋巴细胞稀疏；其中蓝紫色区域为脾白髓淋巴小结；内毒素组中24 h亚组脾细胞充血肿大，脾血窦内红细胞数量增多，脾索及脾血窦内可见中性粒细胞渗出及浸润，脾白髓淋巴小结反应性增多；12 h亚组病变情况较24 h亚组轻；胍丁胺组中12 h及24 h亚组脾细胞肿大及充血明显较内毒素组改善，脾血窦及脾索内炎细胞明显减少，脾白髓淋巴小结也较前减少，脾脏结构逐渐恢复到正常状态。见图 1~3。

图 1 对照组中各亚组的脾脏组织HE染色图（×100） Fig 1 HE staining of spleen tissues in the control group (× 100)

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图 2 内毒素组中各亚组的脾脏组织HE染色图（× 100） Fig 2 HE staining of spleen tissues in the endotoxin group (× 100)

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图 3 胍丁胺组中各亚组的脾脏组织HE染色示意图（× 100） Fig 3 HE staining of spleen tissues in the agmatine group

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左上象限代表死亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左下象限代表正常细胞 图 4 对照组大鼠不同时间点脾细胞总凋亡率 Fig 4 Apoptotic rate of splenocytes at each time point in the control group

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左上象限代表死亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左下象限代表正常细胞 图 5 内毒素组大鼠不同时间点脾细胞总凋亡率 Fig 5 Apoptotic rate of splenocytes at each time point in the endotoxin group

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左上象限代表死亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左下象限代表正常细胞 图 6 胍丁胺组大鼠不同时间点脾细胞总凋亡率 Fig 6 Apoptotic rate of splenocytes at each time point in the agmatine group

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与对照组的12 h、24 h亚组相比较，内毒素组对应的亚组的脾脏细胞总凋亡率均明显升高，与内毒素组的12 h、24 h亚组相比较，胍丁胺组对应的亚组中脾脏细胞总凋亡率均明显下降（均P < 0.05）；与同组的0 h亚组相比较，内毒素组及胍丁胺组的12 h亚组的脾脏细胞总凋亡率均明显升高，与同组的12 h亚组比较，内毒素组及胍丁胺组的24 h亚组的脾脏细胞总凋亡率均明显升高（均P < 0.05）。

左上象限代表死亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左下象限代表正常细胞 图 7 对照组大鼠不同时间点DCs总凋亡率 Fig 7 Apoptotic rate of DCs at each time point in the control group

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左上象限代表死亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左下象限代表正常细胞 图 8 内毒素组大鼠不同时间点DCs总凋亡率 Fig 8 Apoptotic rate of DCs at each time point in the endotoxin group

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左上象限代表死亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左下象限代表正常细胞 图 9 胍丁胺组大鼠不同时间点DCs总凋亡率 Fig 9 Apoptotic rate of DCs at each time point in the agmatine group

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与对照组的12 h、24 h亚组相比较，内毒素组对应亚组中脾脏DCs总凋亡率均明显升高，与内毒素组的12 h、24 h亚组相比较，胍丁胺组对应亚组中脾脏DCs总凋亡率均明显下降（均P < 0.05）；与同组的0h亚组相比较，内毒素组及胍丁胺组12h亚组中脾脏DCs凋亡率均明显升高，与同组的12 h亚组比较，内毒素组及胍丁胺组的24 h亚组中脾脏DCs凋亡率均降低，而不是升高，这与脾脏细胞总凋亡率的变化趋势有所不同，但其差异也有统计学意义（P < 0.05）。

免疫抑制是脓毒症患者后期并发二次感染的主要原因，有效逆转免疫抑制状态可能会切实改善疾病预后。脾脏作为机体质量要免疫器官主要由淋巴细胞组成，是脓毒症常累及的器官之一，这也是脓毒症合并机体免疫功能紊乱的主要原因之一。树突状细胞（DCs）作为机体固有免疫应答和获得免疫应答的纽带^[9]参与T细胞依赖性免疫应答的启动和调节^[10]。机体包括脾脏在内的免疫器官及血液中的DCs与脓毒症发生发展密切相关。该实验研究通过流式细胞术分别检测了对照组、内毒素组不同时间点的大鼠脾脏细胞及DCs总凋亡率。结果显示内毒素组中12 h、24 h亚组的脾脏细胞及DCs总凋亡率与对照组相比均明显升高，提示脓毒症诱发免疫功能抑制状态的存在。

依靠微环境和信号传导，树突状细胞可以分泌促炎细胞因子来对抗感染，也可以分泌抗炎细胞因子来维持对自身组织的耐受性。在全身性炎症反应过程中同时激活过多的常规DCs（cDC），包括CD8⁺ cDC和CD11b cDC，会耗尽机体中功能齐全的DCs，因此表现为免疫抑制状态^[11]。Liu等^[13]发现脓毒症诱发急性肺损伤（ALI），肺脏、循环和脾脏中DCs产生不同的数量和表型变化，可能参与了对ALI的早期炎症反应。脓毒症也可诱发急性肾损伤（AKI），DCs和中性粒细胞分别通过释放炎性细胞因子和活性氧（ROS）在AKI的发展中起决定性作用，Al-Harbi等^[13]发现，Syk信号通路在DCs和中性粒细胞中起着关键作用，因此Syk抑制可能是限制AKI炎症级联反应的有效策略。据报道，通过盲肠结扎穿刺建立的脓毒症大鼠模型循环中存在DCs凋亡^[14]。脓毒症中DCs凋亡的机制尚不清楚，有研究表明，大肠杆菌感染DCs后可激活酸性鞘磷脂酶（A-SMase），诱导DCs凋亡^[15]。该实验结果显示脾脏细胞凋亡率随建模时间延长呈上升趋势，而DCs总凋亡率在建模后12 h时达到高峰，可能因不同细胞特性相关。除了通过减少DCs数量来诱导免疫抑制外，DCs凋亡过程中还可诱导耐药微环境维持免疫抑制状态。脓毒症患者中循环性cDC和DC前体（pDC）数量的持续减少与继发感染的风险有关^[6]。因此早期动态监测机体淋巴细胞或DCs水平已成为评估脓毒症患者病情及预后的一种有效方法。

胍丁胺作为多种神经受体的重要调控者广泛分布于哺乳动物体内，可作用于体内多个分子靶点，包括神经递质系统、一氧化氮（NO）合成和聚胺代谢，因此在机体内的病理生理过程中具有重要作用^[17]。Amiri等^[18]在6-羟基多巴胺诱导帕金森氏病的模型研究中发现，胍丁胺可通过影响Akt /糖原合成激酶3β（GSK-3β）和细胞外信号调节激酶（ERK）信号传导而具有神经保护作用。同时胍丁胺在脓毒症模型研究中也被证实有多种器官保护作用。胍丁胺可通过降低NO与TNF-α生成、减轻氧化应激反应对肝衰竭大鼠模型起到护肝作用^[19]。在高氧诱导的肺损伤大鼠模型中发现，胍丁胺可降低高氧引起的lncRNA gadd7表达上调对肺损伤有保护作用^[20]。为阐明胍丁胺是否对脾脏淋巴细胞和DCs的凋亡有抑制作用，该实验研究通过流式细胞术分别检测了内毒素组及胍丁胺组不同时间点的大鼠脾脏细胞及DCs总凋亡率。胍丁胺组中12 h、24 h亚组的脾脏细胞及DCs总凋亡率与内毒素组相比均明显降低，证实胍丁胺能够抑制脓毒症大鼠脾脏细胞及DCs的凋亡。涂丽娜等^[21]在胶原诱导性关节炎大鼠模型实验中发现脾脏细胞炎症反应时TLR4 mRNA表达量升高。徐荣等^[22]发现自身免疫性炎症小鼠模型脾脏DCs的TLR4表达量升高。提示脾脏细胞及DCs炎症反应与其表面TLR4分子表达存在相关性。而胍丁胺是否通过TLR4分子途径抑制脓毒症大鼠脾脏细胞及DCs凋亡的科学问题还需进一步科学研究。

该研究还分别通过测量大鼠脾脏重量及脾脏组织HE染色法发现脓毒症时大鼠脾脏组织充血、重量增加以及典型病理变化，胍丁胺可有效改善上述病变情况，对脓毒症大鼠脾脏有器官保护作用。基于此研究发现脾细胞、DCs的凋亡与脓毒症的发生发展密切相关，胍丁胺可抑制脓毒症大鼠脾细胞、DCs的凋亡。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突