2022, Vol. 31
2. 苏州大学附属第一医院重症医学科，苏州 215006
2. Intensive Care Unit, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, China
心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation, CPR）术的普及和发展已经使越来越多的心脏骤停（cardiac arrest, CA）患者受益，极大地提高了患者的自主循环恢复（return of spontaneous circulation, ROSC）率，但即使在欧洲发达地区，出院存活率仍然不足20%[1-2]。心脏骤停后综合征（post-cardiac arrest syndrome, PCAS）是指CA后机体全身缺血- 再灌注损伤引起的多器官功能障碍，其中心脏是最主要的受损靶器官之一，复苏后心肌损伤会导致严重心功能障碍，是ROSC后早期死亡的主要原因[3-4]。
线粒体是一种高度动态的细胞器，其形态和数量的不断变化主要通过线粒体分裂和融合来完成[5]。正常情况下，线粒体分裂和融合处于一个动态的平衡中。但在病理条件下，这种动态平衡会被打破，从而影响线粒体功能，导致细胞损伤[6]。线粒体分裂与融合的失衡已经在一些疾病如肥胖、糖尿病、癌症及心血管疾病中被发现[7-9]。笔者前期研究已证实线粒体分裂和融合出现失衡，会影响ROSC后脑损伤的发生发展[10]，但其是否参与复苏后心肌损伤的病理过程尚不明确。本研究旨在通过构建大鼠CA模型，观察心脏中线粒体分裂与融合的变化，探讨这种线粒体动态失衡在ROSC后心肌损伤中的作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，体重320~380 g，由苏州大学动物实验中心提供[动物许可证号：SYXK（苏）2017-0043]。动物须在SPF级饲养房饲养一周后才进行实验，本研究经苏州大学实验动物伦理委员会批准。按随机数字法将大鼠随机分为4组，分别是假手术组（Sham），复苏后（post-resuscitation, PR）4 h组、PR 24 h组、PR 72 h组。其中Sham组6只，其余各组每组12只。
1.2 动物模型的制备七氟醚（恒瑞公司，江苏）诱导麻醉后，以30 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥（Sigma公司，美国）麻醉，常规气管插管，外接红外线呼气末二氧化碳监测仪（Instrumentation laboratory公司，美国）检测呼气末二氧化碳分压（end-tidal carbon dioxide partial pressure, ETCO2），解剖分离股动静脉并置管，动脉管监测主动脉压，静脉管用于给药。持续记录肢体Ⅱ导联心电图，监测体温并维持肛温在（36.5± 0.5）℃。
采用窒息法建立大鼠CA模型[11]，以平均动脉压（MAP）≤ 20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作为模型成功建立的标准。CA 6 min后进行胸外心脏按压，按压频率约为200次/min，同时给予呼吸机辅助呼吸，通气频率为50次/min，潮气量为5 mL/kg，吸入氧体积分数为100%。持续胸外按压2 min后若未能ROSC，静脉给予肾上腺素0.025 mg/kg，必要时间隔2 min可重复给药。ROSC定义为恢复自主室上性心律，MAP ≥ 60 mmHg维持10 min以上，若持续按压4 min ROSC未恢复则认定为复苏失败。继续监测ROSC后的大鼠2 h后脱掉呼吸机，拔除导管回笼。各组动物分别于ROSC后4 h、24 h及72 h后麻醉处死，解剖心脏留取左室心肌组织备检。
1.3 线粒体的分离及提取分离新鲜的心肌组织，称重后放入预冷的Dounce匀浆器进行匀浆，取上清液差速离心获得最终沉淀，即为提取的线粒体，重悬线粒体置于冰浴中待用。
1.4 Westernblot检测Drp1、Fis1、Mfn1及Opa1蛋白裂解心肌组织提取总蛋白，用BCA法定量后，进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜。5% 脱脂牛奶封闭后，分别加入Drp1（1 ︰ 1 000，Cell Signaling Technology公司，美国）、Fis1（1 ︰ 500，Santa Cruz公司，美国）、Mfn1（1 ︰ 1 000，Cell Signaling Technology公司，美国）及Opa1（1 ︰ 1 000，Cell Signaling Technology公司，美国）抗体，4℃孵育过夜，TBST溶液振摇洗3次，每次5 min，加入二抗室温下孵育1 h，以VDAC1作为内参，增强型化学发光试剂盒显影，用Gel-pro分析软件测定各样本灰度值。
1.5 RT-PCR检测Drp1、Fis1、Mfn1及Opa1 mRNATrizol法提取总RNA，根据试剂盒说明书操作进行逆转录。引物序列查自NCBI数据库，由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。Drp1正向引物序列：CCAGGAATGACCAAGGTCCC，反向引物序列：CCTCGTCCATCAGGTCCAAC；Fis1正向引物序列：TTTGAATACGCCTGGTGCCT，反向引物序列：TACCTTTGGGCAACA；Mfn1正向引物序列：AGCTCAAGGTTGTGAGTCCT，反向引物序列：CATCCCCTGGGCTTTATTCA；Mfn2正向引物序列：CATCCCCTGGGCTTTATTCA，反向引物序列：CTCCGTGGTGACATCGATCC。反应体系20 μ L；扩增条件：95℃预变性1 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，反应40个循环。以β -actin为内参，采用2-ΔΔ Ct计算mRNA相对表达量。
1.6 心肌ATP水平检测将ATP检测裂解液加入分离的心肌组织，在预冷的Dounce匀浆器进行匀浆（Kimble公司，美国），4℃ 12 000 g高速离心5 min后取上清液，用化学发光法检测样本。详细步骤按照试剂盒操作说明书进行，最后把ATP浓度换算成nmol/g protein的形式来反映ATP的实际含量。
1.7 线粒体呼吸功能检测采用Oxytherm液相氧电极（Hansatech Instruments公司，英国）测量线粒体Ⅲ态呼吸和Ⅳ态呼吸。室温下先进行仪器校正，在反应槽中加入反应介质，基线平稳后加入20 μ L线粒体悬液，记录1 min后加入反应底物，出现Ⅳ态呼吸，记录为R4，2 min后加入ADP底物，出现Ⅲ态呼吸，记录为R3。线粒体呼吸控制率（respiratory control ratio, RCR）=R3/R4。
1.8 心肌组织病理学染色取心肌组织用生理盐水冲洗干净，4% 多聚甲醛固定，经石蜡包埋固定、切片、常规苏木精- 伊红（HE）染色后，光镜下观察心肌病理学形态变化。
1.9 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料进行正态性检验，符合正态分布的资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠基线信息及复苏结果各组大鼠体重、心率、MAP、ETCO2、CPR时间、肾上腺素用量、体内酸碱度及肛温的基线值比较，差异无统计学意义（P > 0.05，表 1）。
| 指标 | Sham组 (n=6) |
PR 4 h组 (n=12) |
PR 24 h组 (n=12) |
PR 72 h组 (n=12) |
F值 | P值 |
| 体重（g） | 343±13 | 346±15 | 341±19 | 338±16 | 0.50 | 0.683 |
| 心率（次/min） | 366±33 | 373±30 | 378±34 | 369±32 | 0.25 | 0.863 |
| MAP（mmHg） | 131±9 | 132±11 | 137±14 | 135±12 | 0.51 | 0.677 |
| ETCO2（mmHg） | 42±4 | 41±3 | 43±3 | 41±2 | 1.28 | 0.295 |
| CPR时间（s） | - | 255±127 | 233±108 | 246±113 | 0.11 | 0.897 |
| 肾上腺素（μg） | - | 17±8 | 16±9 | 19±7 | 0.43 | 0.652 |
| pH值 | 7.42±0.03 | 7.41±0.04 | 7.43±0.03 | 7.41±0.02 | 1.13 | 0.348 |
| 肛温(℃) | 36.8±0.44 | 36.7±0.28 | 37.0±0.35 | 36.9±0.31 | 1.74 | 0.175 |
| 注：MAP为平均动脉压；ETCO2为呼吸末二氧化碳分压；CPR为心肺复苏 | ||||||
PR 4 h、PR 24 h及PR 72 h组线粒体Drp1蛋白较Sham组显著升高（均P < 0.05，图 1），且PR 24 h组低于PR 4 h组（P < 0.05），PR 72 h组低于PR 24 h组（P < 0.05）。PR 4 h及PR 24 h组线粒体Fis1蛋白较Sham组显著升高（均P < 0.05），且PR 24 h组低于PR 4 h组（P < 0.05），PR 48 h组与Sham组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。PR 4 h及PR 24 h组线粒体Mfn1及Opa1蛋白较Sham组显著下降（均P < 0.05），且PR 24 h组高于PR 4 h组（P < 0.05），PR 72 h组与Sham组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
|
| 与Sham组比较，aP < 0.05；与PR 4 h组比较，bP < 0.05；与PR 24 h组比较，cP < 0.05 图 1 各组大鼠线粒体Drp1、Fis1、Mfn1及Opa1蛋白的表达 Fig 1 Protein expression of Drp1, Fis1, Mfn1 and Opa1 in each group |
|
|
PR 4 h及PR 24 h组线粒体Drp1和Fis1 mRNA表达均较Sham组显著升高（均P < 0.05，表 2），且PR 24 h组低于PR 4 h组（P < 0.05），PR 72 h组与Sham组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。PR 4 h、PR 24 h及PR 72 h组线粒体Mfn1 mRNA表达较Sham组显著降低（均P < 0.05），PR 24 h组低于PR 4 h组（P < 0.05），PR 72 h组低于PR 24 h组（P < 0.05）。PR 4 h及PR 24 h组线粒体Opa1 mRNA表达较Sham组显著下降（均P < 0.05），PR 24 h组高于PR 4 h组（P < 0.05），PR 72 h组与Sham组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
| 组别 | Drp1 mRNA | Fis1 mRNA | Mfn1 mRNA | Opa1 mRNA |
| Sham组(n=6) | 0.26±0.07 | 0.45±0.11 | 2.78±0.18 | 2.56±0.21 |
| PR 4 h组(n=12) | 1.73±0.25a | 2.42±0.27a | 0.95±0.12a | 0.71±0.24a |
| PR 24 h组(n=12) | 0.88±0.23ab | 1.65±0.16ab | 1.63±0.16ab | 1.81±0.17ab |
| PR 72 h组(n=12) | 0.34±0.14bc | 0.61±0.09bc | 2.54±0.22bc | 2.39±0.19bc |
| 注：与Sham组比较，aP < 0.05；与PR 4 h组比较，bP < 0.05；与PR 24 h组比较，cP < 0.05 | ||||
PR 4 h及PR 24 h组心肌ATP含量（[4.53± 0.76）nmol/g protein；（5.58± 0.58）nmol/g protein] 均显著低于Sham组[（8.57± 0.44）nmol/g protein]（均P < 0.05），PR 72 h组[（7.73± 0.95）nmol/g protein] 高于PR 24 h组（P < 0.05），但PR 72 h组与Sham组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2A。PR 4 h及PR 24 h组线粒体RCR值[（2.47± 0.38）；（2.97± 0.24）] 较Sham组显著下降（3.45± 0.32）（均P < 0.05），PR 72 h组（3.39± 0.34）较PR 24 h组显著升高（P < 0.05），但PR 72 h组与Sham组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2B。
|
| A：ATP水平的比较；B：线粒体RCR的比较；与Sham组比较，aP < 0.05；与PR 4 h组比较，bP < 0.05；与PR 24 h组比较，cP < 0.05 图 2 各组大鼠ATP含量及线粒体呼吸功能的比较 Fig 2 Comparison of ATP content and mitochondrial respiration in each group |
|
|
Sham组HE染色结果显示，心肌细胞膜完整，肌纤维排列整齐，无炎性细胞浸润；PR 4 h组心肌细胞肿胀，肌纤维断裂溶解，有大量炎性细胞及红细胞浸润；PR 72 h组无明显心肌细胞肿胀，肌纤维断裂，可见局部少量炎性细胞浸润，见图 3。
|
| A：Sham组；B：PR 4 h组；C：PR 72 h组 图 3 各组大鼠心肌病理学改变（HE × 400） Fig 3 Pathological changes of myocardial tissue in each group (HE × 40) |
|
|
早期ROSC后心肌损伤会引起血流动力学不稳定，复苏时间越长，这种不稳定就越明显，心肌的这种缺血- 再灌注损伤临床上可出现器官灌注不足、恶性心律失常甚至室颤等表现[12]。线粒体是细胞内重要的细胞器，通过氧化磷酸化产生ATP为细胞提供必需的能量。心肌中富含线粒体，心肌细胞的正常收缩及代谢离不开线粒体。最近有研究表明，CA时心肌细胞中线粒体功能会发生极大损伤，而减轻线粒体损伤或者恢复线粒体功能的治疗可明显改善ROSC后心功能，保护缺血- 再灌注后的心脏[13-14]。因此，线粒体功能损伤很有可能是CA/ ROSC后心肌损伤发生发展的重要病理生理机制。
线粒体的分裂和融合是在多种蛋白质的精细调控下完成的，这两种过程既相互依赖又相互对立。调控线粒体分裂的蛋白主要是Drp1和Fis1。Drp1主要定位胞浆中，转位至线粒体外膜后通过其GTP酶活性压缩线粒体直至分裂[15]。有研究发现Drp1介导的线粒体分裂参与了哺乳动物的细胞凋亡过程[16]。Drp1的基因突变或抑制Drp1的表达可引起心肌细胞的线粒体融合，从而改善心肌缺血性损伤[17]。笔者前期研究也发现使用线粒体过度分裂抑制剂对全脑缺血性损伤有明显的保护作用[18]。Fis1是一种小分子锚定蛋白，并不专门定位于线粒体分裂位点上，而是紧密排列分布在线粒体外膜上，作为Drp1受体蛋白，通过招募Drp1至线粒体外膜上来促进线粒体分裂[19]。线粒体的融合过程主要由Mfn1/2和Opa1调节。Mfn1和Mfn2广泛分布于线粒体外膜上，介导线粒体外膜的融合；而Opa1则定位于线粒体内膜，介导线粒体内膜的融合。Mfn1或Mfn2缺陷会引起线粒体融合障碍，出现大量碎片状线粒体，最终导致中期胚胎死亡[20]；在心肌细胞给予缺血处理后Opa1蛋白会出现丢失，基因沉默Opa1还会导致线粒体片段化和细胞凋亡[21]。Mfn1和Mfn2作用具有一定的相似性，因此本研究中选择Mfn1作为融合蛋白的代表。在本实验中，线粒体融合蛋白Mfn1和Opa1在ROSC后4 h时明显下降，而分裂蛋白Drp1和Fis1则明显升高，这种改变不仅体现在蛋白质水平，还在基因转录水平上得到了验证，提示ROSC后早期线粒体即出现过度分裂，但在72 h时已恢复至CA前的状态。这种动态改变表明CA/ROSC后心肌线粒体出现了暂时性的分裂和融合失衡。
线粒体产生的ATP是心肌能量代谢的主要物质来源，CA时心肌即刻出现缺血缺氧，线粒体出现损伤，ATP生成发生障碍。虽然成功ROSC，但再灌注后的心肌会触发多种损伤机制，线粒体损伤甚至会进一步加重，引起ATP水平迅速减少，最终导致细胞死亡。有研究表明，心肌ATP的水平与其收缩能力呈正相关，而能量代谢的改善能够减轻心肌细胞损伤[22]。线粒体呼吸的多种状态中以Ⅲ / Ⅳ态最重要，通过两者的比值可以得到代表线粒体呼吸功能的RCR，反映线粒体氧化磷酸化效率。本实验结果显示ROSC 4 h时RCR明显下降，ATP含量只有正常情况下的一半，这可能是心肌缺血缺氧使线粒体呼吸链受损，电子无法传递，氧化磷酸化过程解偶联所致，但72 h时RCR和ATP含量已恢复至正常水平。RCR的一过性下降及心肌ATP水平的恢复说明线粒体功能的损伤具有可逆性。
ROSC后即刻出现严重的病理生理改变，心肌的“无复流”与缺血- 再灌注损伤可加重心肌水肿，引起心肌顺应性降低，最终导致心脏功能障碍，但这种早期发生的心肌损伤可在72 h后开始逐渐恢复[23]。在使用猪进行长达10 min或15 min的CA模型中，ROSC后心功能在48 h内可恢复[24]。本研究也发现72 h时心肌病理损伤已恢复至正常水平，这与以往的研究中ROSC后心肌损伤的特点相符[25]。
综上所述，CA/ROSC心肌缺血- 再灌注后，出现线粒体的分裂和融合失衡，主要表现为分裂增多，融合减少，但72 h后这种动态失衡可完全恢复。过度的线粒体分裂往往是有害的，提示早期的线粒体动态失衡参与了复苏后心肌损伤的发生，其机制可能与线粒体功能受损有关。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 陈明迪：实验操作、论文撰写；张珏、王思盼：数据收集及整理、统计学分析；杨鹏、陆士奇：技术支持及指导；李毅：研究设计、论文修改
| [1] | Nolan JP, Soar J, Smith GB, et al. Incidence and outcome of inhospital cardiac arrest in the United Kingdom National Cardiac Arrest Audit[J]. Resuscitation, 2014, 85(8): 987-992. DOI:10.1016/j.resuscitation.2014.04.002 |
| [2] | Radeschi G, Mina A, Berta G, et al. Incidence and outcome of inhospital cardiac arrest in Italy: A multicentre observational study in the Piedmont Region[J]. Resuscitation, 2017, 119: 48-55. DOI:10.1016/j.resuscitation.2017.06.020 |
| [3] | Binks A, Nolan JP. Post-cardiac arrest syndrome[J]. Minerva Anestesiol, 2010, 76(5): 362-368. |
| [4] | Berden J, Steblovnik K, Noc M. Mechanism and extent of myocardial injury associated with out-of-hospital cardiac arrest[J]. Resuscitation, 2019, 138: 1-7. DOI:10.1016/j.resuscitation.2019.02.026 |
| [5] | Chen H, Chan DC. Emerging functions of mammalian mitochondrial fusion and fission[J]. Hum Mol Genet, 2005, 14 Spec No. 2: R283-R289. DOI:10.1093/hmg/ddi270 |
| [6] | Westermann B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010, 11(12): 872-884. DOI:10.1038/nrm3013 |
| [7] | Maycotte P, Marín-Hernández A, Goyri-Aguirre M, et al. Mitochondrial dynamics and cancer[J]. Tumour Biol, 2017, 39(5): 1010428317698391. DOI:10.1177/1010428317698391 |
| [8] | Zorzano A, Liesa M, Palacín M. Role of mitochondrial dynamics proteins in the pathophysiology of obesity and type 2 diabetes[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(10): 1846-1854. DOI:10.1016/j.biocel.2009.02.004 |
| [9] | Ong SB, Hall AR, Hausenloy DJ. Mitochondrial dynamics in cardiovascular health and disease[J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 19(4): 400-414. DOI:10.1089/ars.2012.4777 |
| [10] | Li Y, Tang Q, Wang P, et al. Dynamic changes of mitochondrial fusion and fission in brain injury after cardiac arrest in rats[J]. Biomed Res Int, 2017, 2017: 1948070. DOI:10.1155/2017/1948070 |
| [11] | Wu J, Li Y, Yang P, et al. Novel role of carbon monoxide in improving neurological outcome after cardiac arrest in aged rats: involvement of inducing mitochondrial autophagy[J]. J Am Heart Assoc, 2019, 8(9): e011851. DOI:10.1161/jaha.118.011851 |
| [12] | Nolan JP, Berg RA, Andersen LW, et al. Cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation outcome reports: update of the utstein resuscitation registry template for in-hospital cardiac arrest: a consensus report from a task force of the international liaison committee on resuscitation (American Heart Association, European Resuscitation Council, Australian and New Zealand Council on resuscitation, heart and stroke foundation of Canada, InterAmerican Heart Foundation, Resuscitation Council of Southern Africa, Resuscitation Council of Asia)[J]. Circulation, 2019, 140(18): e746-e757. DOI:10.1161/cir.0000000000000710 |
| [13] | Gazmuri RJ, Radhakrishnan J. Protecting mitochondrial bioenergetic function during resuscitation from cardiac arrest[J]. Crit Care Clin, 2012, 28(2): 245-270. DOI:10.1016/j.ccc.2012.02.001 |
| [14] | Ayoub IM, Radhakrishnan J, Gazmuri RJ. Targeting mitochondria for resuscitation from cardiac arrest[J]. Crit Care Med, 2008, 36(11 suppl): S440-S446. DOI:10.1097/ccm.0b013e31818a89f4 |
| [15] | Smirnova E, Griparic L, Shurland DL, et al. Dynamin-related protein Drp1 is required for mitochondrial division in mammalian cells[J]. Mol Biol Cell, 2001, 12(8): 2245-2256. DOI:10.1091/mbc.12.8.2245 |
| [16] | Ugarte-Uribe B, García-Sáez AJ. Membranes in motion: Mitochondrial dynamics and their role in apoptosis[J]. Biol Chem, 2014, 395(3): 297-311. DOI:10.1515/hsz-2013-0234 |
| [17] | Ong SB, Subrayan S, Lim SY, et al. Inhibiting mitochondrial fission protects the heart against ischemia/reperfusion injury[J]. Circulation, 2010, 121(18): 2012-2022. DOI:10.1161/circulationaha.109.906610 |
| [18] | 李毅, 王鹏, 林嘉莉, 等. 线粒体分裂抑制剂对心肺复苏后脑功能及神经元凋亡的影响[J]. 中华危重病急救医学, 2015, 27(12): 950-954. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2015.12.002 |
| [19] | Yoon Y, Krueger EW, Oswald BJ, et al. The mitochondrial protein hFis1 regulates mitochondrial fission in mammalian cells through an interaction with the dynamin-like protein DLP1[J]. Mol Cell Biol, 2003, 23(15): 5409-5420. DOI:10.1128/mcb.23.15.5409-5420.2003 |
| [20] | Chen H, Detmer SA, Ewald AJ, et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development[J]. J Cell Biol, 2003, 160(2): 189-200. DOI:10.1083/jcb.200211046 |
| [21] | Chen L, Gong Q, Stice JP, et al. Mitochondrial OPA1, apoptosis, and heart failure[J]. Cardiovasc Res, 2009, 84(1): 91-99. DOI:10.1093/cvr/cvp181 |
| [22] | Schwarzer M, Doenst T, Des Rosiers C, et al. The power of metabolism - Linking energy supply and demand with cardiac contractile function[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865(4): 725-727. DOI:10.1016/j.bbadis.2019.02.006 |
| [23] | Chalkias A, Xanthos T. Pathophysiology and pathogenesis of postresuscitation myocardial stunning[J]. Heart Fail Rev, 2012, 17(1): 117-128. DOI:10.1007/s10741-011-9255-1 |
| [24] | Kern KB, Hilwig RW, Rhee KH, et al. Myocardial dysfunction after resuscitation from cardiac arrest: an example of global myocardial stunning[J]. J Am Coll Cardiol, 1996, 28(1): 232-240. DOI:10.1016/0735-1097(96)00130-1 |
| [25] | 赵燊, 何宇敏, 许冰, 等. 大鼠心肺复苏后心功能不全动态评价模型的研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(1): 44-50. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2017.01.009 |