2022, Vol. 31
2. 昆明医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，昆明 650500
2. Department of Anatomy and Histology/Embryology, Faculty of Basic Medical Sciences, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是严重的公共卫生问题，是全球范围内导致全年龄段死亡和残疾的主要原因[1]。TBI包括直接撞击引起的原发损伤，以及后续触发的病理生理级联反应导致的继发性损伤。原发损伤不可逆转，因此，继发性损伤是TBI治疗的关键靶点和窗口，继发性损伤始于炎症活动，目前针对凋亡、自噬等的干预手段未取得满意的疗效，神经炎症逐渐引起研究者重视[2]。小胶质细胞（microglial, MG）是中枢神经系统中的巨噬细胞，具有吞噬和抗原呈递作用[3]，在介导神经炎症反应中具有重要意义。脑损伤过程中，MG可以被激活和极化为不同表型，发挥促炎（M1表型）或抗炎（M2表型）作用，因此促进MG向M2表型转变是TBI潜在治疗方法。细胞核转录因子κB（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）作为炎症和免疫中的关键转录因子，当MG被细胞活化因子刺激时，由于NF-κB的p65亚基具有核定位信号[4]，p65亚基由细胞质易位到细胞核，发挥免疫调节和炎症效应，MG核中p65含量升高提示NF-κB激活。右美托咪定（dexmedetomidine, DEX）是一种选择性中枢α2-肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、抗焦虑、抗交感等作用[5]，许多研究已证实DEX对多种器官具有保护作用，涉及的机制主要有抑制细胞凋亡、氧化应激和调控自噬等[6]，而对TBI后神经炎症的作用和机制尚不清楚。本研究旨在探究DEX是否通过抑制NF-κB核易位调节TBI后MG的极化，从而抑制神经炎症。
1 材料与方法 1.1 实验动物成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250~300 g，购自昆明医科大学实验动物学部，在标准照明（12 h光照/黑暗）和标准环境（温度20~25 ℃，湿度55%~65%）中饲养，自由进食和饮水。动物实验经昆明医科大学实验动物伦理委员会批准（审批号：kmmu2021148）。
1.2 主要试剂使用试剂包括DEX（江苏恩华药业，中国），IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和IL-10 ELISA试剂盒（江莱生物，中国），精氨酸酶-1（arginase-1, Arg-1）、IL-10、IL-1β、TNF-α抗体（万类、中国），NF-κB p65、Iba-1、β-actin、GAPDH抗体（abcam、英国），山羊抗兔、山羊抗小鼠荧光二抗（Proteintech公司、中国）。
1.3 TBI模型建立及实验分组根据改良Feeney自由落体法[7]建立TBI大鼠模型。4%水合氯醛（7 mL/kg，腹腔注射）麻醉，固定大鼠于脑立体定位仪，消毒后切开头皮暴露颅骨，以冠状缝后2 mm、矢状缝右2.5 mm为圆心，开直径为5 mm的骨窗。将40 g砝码从15 cm高度垂直落下，造成右侧顶叶皮质中度损伤。将42只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（sham组）、TBI组、TBI+DEX组、TBI+PDTC组和TBI+DEX+PDTC组，每组6只，造模后2 h腹腔注射DEX 100 μg/kg，1 h腹腔注射PDTC 100 mg/kg，每隔24 h给药，共7 d，DEX设置为给药1 d、3 d、7 d组3个时间梯度，sham组和TBI组予等体积生理盐水。
1.4 神经功能评估使用改良的神经严重程度评分（modified neurological severity scores，mNSS）评估神经功能，包括运动、感觉、反射和协调能力。评分为0~18分，分数越高表示脑损伤越重。
1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）取2 mL全血，离心后取上清备用。按照说明书，建立标准品及空白孔，将待测样品50 μL加入样品孔，37 ℃水浴1 h，加入终止液，读取波长450 nm处样品孔的吸光度，测定各组血清中IL-1β、TNF-α和IL-10含量。
1.6 免疫荧光染色经心尖插管灌注固定后取脑组织制作成4~6 μm石蜡切片。脑切片经脱蜡水化、抗原修复，使用3% PBST破膜，10%山羊血清封闭2 h，加双重荧光一抗∶兔抗大鼠Iba-1（1∶200），小鼠抗大鼠NF-κB p65（1∶600），4 ℃孵育过夜，次日PBST漂洗，荧光二抗室温避光孵育2 h，用含有DAPI的封片剂封片，荧光显微镜观察拍照。
1.7 Western Blot从-80 ℃冰箱中取出待检组织，提取胞浆和胞核蛋白，BCA法测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。不同实验组分别用MyD88（1∶2 000）；NF-κB p65（1∶2 000）；IL-1β（1∶500）、TNF-α（1∶800）、Arg-1（1∶800）、IL-10（1∶1 000）；β-actin（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，次日室温孵育二抗1 h。ECL发光液显影，Image J分析条带吸光度。
1.8 统计学方法采用GraphPad Prism9软件进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素及双因素方差分析，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 DEX降低TBI大鼠mNSS评分TBI组各时间点mNSS评分显著高于sham组（P < 0.05）；与TBI组相比，DEX治疗时间依赖性地降低mNSS评分，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。
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| 与sham组比较，aP < 0.05；与TBI组比较，bP < 0.05；n=6/组 图 1 DEX对TBI大鼠mNSS评分的影响 Fig 1 The effect of DEX on neurological function after TBI |
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ELISA检测显示，与sham组相比，TBI大鼠血清中促炎因子IL-1β和TNF-α显著升高（P < 0.05，图 2A、B），抗炎因子IL-10显著降低（P < 0.05，图 2C）。DEX治疗后，IL-1β和TNF-α明显下降，IL-10明显升高，差异有统计学意义（F值分别为22.84、29.33、31.60，P < 0.05）。
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| 与sham组比较，aP < 0.05；与TBI组比较，bP < 0.05；与DEX-1d组比较，cP < 0.05；n=3/组 图 2 DEX对TBI大鼠血清炎症因子的影响 Fig 2 The effect of DEX on inflammatory factors in the serum of rats after TBI |
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与sham组相比，TBI组MG M1标记物（IL-1β、TNF-α）表达明显升高（P < 0.05，图 3A~C），M2标记物（Arg-1、IL-10）表达明显降低（P < 0.05，图 3D、E）；与TBI组相比，DEX治疗降低TNF-α和IL-1β表达，促进Arg-1和IL-10表达，其中，以DEX-7 d组的改变最显著，差异具有统计学意义（F值分别为180.60、120.60、55.88、108.80，P < 0.05）。
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| A：M1和M2标记物蛋白质免疫印迹条带图；B~E：各条带蛋白相对定量统计；与sham组比较，aP < 0.05；与TBI组比较bP < 0.05；与DEX-1d组比较，cP < 0.05；n=3/组 图 3 DEX对TBI后MG极化的影响 Fig 3 The effect of DEX on MG polarization after TBI |
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与sham组比较，TBI后MyD88的表达明显增加，DEX降低MyD88的表达（F=72.49，P < 0.05，图 4A、B）。此外，与sham组比较，TBI组NF-κB p65在胞浆中表达降低，胞核中则升高，DEX促进胞浆NF-κB p65表达，降低其在胞核表达（F值分别为29.82、81.20，P < 0.05，图 4C~E）。免疫荧光结果显示，与sham组比较，TBI后胞核NF-κB p65表达升高，DEX降低其胞核表达（图 4F）。
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| A：MyD88蛋白质免疫印迹条带图；B：MyD88蛋白相对定量统计；C：NF-κB p65胞浆胞核蛋白质免疫印迹条带图；D、E：NF-κB p65胞浆胞核蛋白相对定量统计；F：各组损伤皮质免疫荧光双标，Iba-1显示绿色荧光标记，NF-κB p65显示红色荧光标记，细胞核显示蓝色荧光标记，比例尺=100 μm；与sham组比较，aP < 0.05；与TBI组比较，bP < 0.05；与DEX-1d组比较，cP < 0.05；n=3/组 图 4 DEX抑制NF-κB p65核易位调节MyD88/NF-κB通路 Fig 4 DEX regulates the MyD88/NF-κB pathway by inhibiting the nuclear translocation of NF-κB p65 |
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免疫荧光结果显示，与TBI组相比，PDTC降低NF-κB p65的核表达，PDTC及DEX联合干预进一步降低NF-κB p65的核表达（图 5A）。Western Blot结果显示，与TBI组比较，PDTC处理组NF-κB p65在胞质中表达升高，胞核表达则降低，同时MG M1标记物表达降低（F分别为139.40、61.92，P < 0.05，图 5D、E、I），M2标记物表达明显升高（F分别为45.62、82.64，P < 0.05，图 5F、G、I），PDTC与DEX联用进一步降低NF-κB p65胞核表达而增加其胞质表达，同时促进MG向M2表型极化，差异有统计学意义（F分别为114.90、192.70，P < 0.05，图 5B、C、H）。
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| A：各组损伤皮质免疫荧光双标结果；B、C：NF-κB p65胞浆胞核蛋白相对定量统计；D~G：各标记蛋白相对定量统计；H：NF-κB p65胞浆胞核蛋白质印迹条带图；I：M1、M2标记蛋白质印迹条带图；与sham组比较，aP < 0.05；与TBI组比较，bP < 0.05；与DEX组比较，cP < 0.05；n=3/组 图 5 PDTC对NF-κB通路的影响 Fig 5 The effect of PDTC on NF-κB pathway |
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本研究证实DEX可改善TBI大鼠神经功能，调节血清中炎症因子表达，还可以调节MG活化，促进M2表型极化，抑制M1表型极化。此外，还证实DEX对MG极化的调节可能与抑制NF-κB p65核易位有关。
DEX是一种高选择性α2肾上腺素受体激动剂，在多种疾病模型中被证实具有神经保护作用，涉及的机制主要包括：抑制交感神经兴奋和调节儿茶酚胺释放、调节中枢谷氨酸释放、抑制细胞凋亡和炎性因子释放、抗氧化应激、以及调节突触可塑性。抑制细胞凋亡和炎性因子的释放被认为是最重要的[8-9]，最近研究表明，DEX通过TLR4/NF-κB通路抑制炎症减轻TBI大鼠早期神经元损伤[10]，但是NF-κB与DEX对MG的影响仍不清楚。本研究聚焦于TBI后MG活化，MG是中枢神经系统中负责调节炎症级联反应的免疫细胞[11]，TBI后MG对其微环境的变化做出反应，形态和表型发生改变，M1型小胶质细胞释放IL-12、诱导型一氧化氮合酶、IL-1β、TNF-α、一氧化氮和MHC Ⅱ等神经毒性分子，导致神经功能障碍和促进炎症反应[12-13]，M2型小胶质细胞释放Arg-1，CD206和IL-10等抗炎因子和神经营养因子以促进组织修复[14]。M1和M2极化之间的平衡是中枢神经系统损伤中神经炎症反应的关键[15]，TBI后MG过度活化，导致神经炎症级联反应[16]，抑制炎症级联反应可能对TBI有保护作用。本研究证实，TBI后大鼠血清中TNF-α和IL-1β显著升高，脑组织中MG主要极化为M1型，DEX抑制促炎因子的释放，提高抗炎因子表达，促进MG向M2型极化，证实DEX通过调节MG极化发挥对TBI的神经保护作用。
文献报道部分转录因子家族参与调节MG向M1型极化，如TLR家族、NF-κB家族、干扰素调节因子、STAT1、p53等，NF-κB p65[17-18]和NF-κB作为炎症和免疫中的关键转录因子，其活化可诱导大量促炎因子的转录，同时被证明参与MG向M1型极化[19]，生理情况下NF-κB与其抑制性蛋白IκB结合，存在于胞质中，有害刺激发生后，TLRs与下游MyD88相互作用并促进NF-κB p65与IκB解离，从胞质易位到胞核，与靶基因结合，调节一系列炎性因子的表达[20-21]。本研究通过形态学和分子生物学也证实，与Sham组比较，NF-κB p65胞核表达增高，DEX处理后NF-κB p65在胞核的表达降低，而给予NF-κB的抑制剂PDTC后，该效应可被增强。
综上所述，DEX可通过抑制NF-κB核易位调节MG极化，减轻TBI后的神经炎症，为神经保护药物的开发提供新思路。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 揭娟：研究设计、实验操作、数据收集整理、论文撰写；杨莉、王纯：论文修改；沈俊：统计学分析；李坪：研究设计；吴海鹰、钱传云：论文修改
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