2022, Vol. 31
2. 南京医科大学第一附属医院急诊中心，南京 210029
缺血性卒中仍然是第二大死亡原因，也是长期致残的主要原因，目前有效治疗脑卒中的药物屈指可数[1]。临床指南中得到广泛推荐的是急性缺血性卒中4.5 h内应用rt-PA溶栓治疗，但溶栓治疗后的脑血管再灌注可加重脑损伤，称之为缺血-再灌注损伤[2]。通过系统性回顾分析发现，他汀类药物可以减轻脑卒中的损伤，促进卒中后神经功能的恢复[3]，但机制不完全清楚。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠（8周）购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，经南京医科大学实验动物伦理委员会许可，严格遵守《实验动物管理条例》进行所有实验操作。
1.2 模型制备及实验分组采用大脑中动脉插入线栓技术诱导局灶性脑缺血腹腔注射10%的水合氯醛350 mg/kg，具体就是分离并结扎右侧颈总动脉和颈外动脉，线栓（豫顺生物科技）通过颈总动脉进入右颈内动脉。缺血120 min后，拔出线栓再灌注24h。
采用随机数字法分为：假手术组（Sham组）、瑞舒伐他汀组（RSV组）、脑缺血-再灌注损伤组（IR组）、IR+RSV组、脑缺血-再灌注损伤+瑞舒伐他汀+溶媒组（RSV+Veh组）、脑缺血-再灌注损伤+瑞舒伐他汀+microRNA对照组（RSV+Scr）及脑缺血-再灌注损伤+瑞舒伐他汀+miR-146a拮抗组（RSV+Ant组）。RSV组在术前连续3 d经腹注射2 mg/kg[4]的瑞舒伐他汀（Merck公司），行假手术操作。IR+RSV组的大鼠术前同样给予瑞舒伐他汀处理。RSV+Ant组在IR+RSV组的基础上，经侧脑室注入1 nmol（50 μL）的miR-146a抑制剂（上海吉玛制药技术有限公司），RSV+Scr组及RSV+Veh组分别注入50 μL的无序microRNA或溶媒液。
1.3 脑梗死体积染色脑组织置于2%的2，3，5－三苯基氯化四氮唑（Merck公司）中染色，拍照后使用ImageJ 1.42软件分析脑梗死的体积。
1.4 神经功能评分24 h后进行神经功能评分，采用Longa标准[5]。
1.5 NSE及炎症因子水平测定NSE试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司）及TNF-α、IL-1β和IL-6试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）按照制造商的说明书进行。
1.6 神经元细胞凋亡测定脑组织石蜡切片先行抗原修复，随后加入50 μL胎牛血清封闭2 h，后加入50 μL的1:300 NeuN抗体（Abcam公司）过夜。然后加入50 μL Cy3荧光二抗，暗盒中37 ℃温育2 h。按照TUNEL说明书（Roche公司）进行操作，最后DAPI进行细胞核染色并封片，通过荧光显微镜观察测定。
1.7 miR-146a的测定采用qRT-PCR测定，按照说明书进行。miR-146a-5p引物序列如下所示，F：5′-ACACTCC AGCTGGGTGAGAACTGAATTCCA-3′及R：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′（上海吉玛制药技术有限公司）。U6为内参照，F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3′；R：5′-ATGGAACGCTTCACGAA TTTGC-3′。
1.8 Western blot检测按照总蛋白及胞浆胞核蛋白裂解液说明书（南京凯基生物）加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roch公司），组织研磨后裂解。BCA（Thermo Fisher公司）测定浓度，每孔上样50 μg。进行凝胶电泳后转膜至0.45 μm孔径的PVDF膜（Millipore公司），5%的脱脂奶粉封闭1 h，分别加入一抗IRAK1、TRAF6、NF-κB、Arg-1及iNOS（Abcam公司，1∶1000），Cleaved Caspase-3（CST公司，1∶500），Bax、Bcl-2、GAPDH及Histone-3（Abmart公司，1∶2000）后4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次后加入对应二抗（1∶5 000）室温孵育2 h。采用ECL化学发光试剂盒显色曝光并采用ImageJ 1.42软件进行分析。
1.9 统计学方法计量资料以均数±标准差（x±s）表示，使用GraphPad Prism软件进行分析，多组比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间采用Newman-Keuls方法检验。两组比较采用成组t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 瑞舒伐他汀在局灶性脑缺血-再灌注损伤中的作用图 1A显示TTC染色，白色代表梗死。瑞舒伐他汀治疗可显著降低脑组织梗死体积（P < 0.05），同时可降低损伤后神经功能的缺损及血清NSE的释放水平（P < 0.05）。见图 1。
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| A：TTC染色结果；B：脑梗死体积百分比；C：神经功能缺损评分；D：血清NSE水平。n=5~10；与IR组比较，aP < 0.05 图 1 瑞舒伐他汀减轻局灶性脑缺血-再灌注的损伤 |
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脑缺血-再灌注损伤后活化的Caspase3表达增加，而瑞舒伐他汀处理可减少活化的Caspase3表达（P < 0.05）。同样，损伤后组织内Bax/Bcl-2蛋白表达的比值明显增加，瑞舒伐他汀降低了损伤后的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值（P < 0.05）。图 2D是脑组织神经元及凋亡细胞的荧光染色，瑞舒伐他汀治疗可减少神经元细胞的凋亡（P < 0.05）。
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| A：目的蛋白Western blot检测图；B-C：各目的蛋白表达的柱状图；D：神经元及TUNEL细胞荧光染色（×400）；E：神经元细胞凋亡的百分比。n=5；与IR组比较，aP < 0.05 图 2 瑞舒伐他汀减轻局灶性脑缺血-再灌注损伤后的细胞凋亡 |
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脑缺血-再灌注损伤后miR-146a表达增加，瑞舒伐他汀治疗使得miR-146a的表达进一步增加（P < 0.05，图 3A）。脑损伤后血清炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6等水平均增加，瑞舒伐他汀治疗减少损伤后炎症因子的释放（P < 0.05，图 3B-D）。脑损伤后组织内炎症通路相关的蛋白IRAK1及TRAF6和胞核蛋白NF-κB表达均增加，瑞舒伐他汀治疗减少了脑损伤后组织内IRAK1及TRAF6蛋白的表达和NF-κB蛋白的核转位（P < 0.05，图 3E-H）。
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| A：miR-146a的表达；B-D：血清炎症因子的表达；E：目的蛋白Western blot检测图；F-H：各目的蛋白表达的柱状图。n=5；与IR组比较，aP < 0.05 图 3 瑞舒伐他汀通过增加脑组织中miR-146a的表达调控IRAK1/TRAF6/NF-κB信号通路 |
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小胶质细胞在激活时主要表现出两种型态，即M1型和M2型，表面标记物分别为iNOS和Arg-1。脑缺血-再灌注损伤后小胶质细胞被激活，M1和M2型细胞相关蛋白均表达增加，瑞舒伐他汀治疗后iNOS表达减少，而Arg-1表达增加（P < 0.05，图 4）。
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| A：目的蛋白Western blot检测图；B-C：各目的蛋白表达的柱状图。n=5；与IR组比较，aP < 0.05 图 4 瑞舒伐他汀调控局灶性脑缺血-再灌注损伤后小胶质细胞的极化 |
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RSV+Ant组经侧脑室给予miR-146a抑制剂，故RSV+Ant组的miR-146a较RSV+Veh和RSV+Scr组表达明显减少（P < 0.05，图 5B），而RSV+Ant组的脑梗死、神经功能缺损及NSE释放水平较其他两组均明显增加（P < 0.05，图C-E）。
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| A：目的蛋白Western blot检测图；B-E：各目的蛋白表达的柱状图。n=5；与RSV+Veh组比较，aP < 0.05 图 5 瑞舒伐他汀发挥神经保护作用依赖miR-146a的表达 |
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RSV+Ant组的IRAK1和TRAF6蛋白表达增加，同时NF-κB蛋白核转位也增加（P < 0.05，图 6B-D）。脑组织miR-146a表达抑制后，炎症因子包括TNF-α、IL-1β及IL-6释放水平较其他两组均显著增加（P < 0.05，图 6E-G）。
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| A：目的蛋白Western blot检测图；B-G：各目的蛋白表达的柱状图。n=5；与RSV+Veh组比较，aP < 0.05 图 6 miR-146a抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB信号通路 |
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本文利用SD大鼠建立局灶性脑缺血-再灌注损伤模型，结果提示瑞舒伐他汀治疗可减少脑梗死体积、神经细胞的凋亡、凋亡相关蛋白包括活化的Caspase3及Bax表达，降低神经功能缺损和血清NSE的释放。因此，瑞舒伐他汀可有效减轻大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤。
炎症在脑卒中病理损伤的发生和发展中发挥重要作用，通过抗炎治疗可以减轻卒中后的脑损伤[6-7]。Toll样受体参与脑缺血-再灌注损伤的发展[8]，IRAK1及TRAF6为其受体的重要下游蛋白，可促进NF-κB蛋白核转位，进而激活神经系统的炎症反应[9-10]。本研究发现瑞舒伐他汀治疗可降低IRAK1及TRAF6蛋白的表达，减少NF-κB核转位，进而减轻炎症因子的释放。
小胶质细胞在脑损伤的炎症反应中发挥重要作用[11-12]，研究已证实M2型小胶质细胞可减轻脑缺血-再灌注后的炎症反应。上述结果表明瑞舒伐他汀可促进小胶质细胞从M1型向M2型极化，再灌注后的炎症进而减轻炎症反应。反应miR-146a是先天性免疫反应的主要负调控因子，通过抑制IRAK1及TRAF6蛋白的表达是其重要机制之一[13-14]，而miR-146a可通过此机制调控肺泡巨噬细胞的炎症反应[15]。通过qRT-PCR检测脑组织miR-146a表达水平，发现瑞舒伐他汀治疗可增加脑缺血-再灌注损伤后组织miR-146a的表达。因此，miR-146a调控的IRAK1/TRAF6/NF-κB信号通路可能参与了瑞舒伐他汀的神经保护作用。
为了证实上述的推论，本研究进一步构建miR-146a的抑制剂。侧脑室注入miR-146a抑制剂可降低其表达，而在瑞舒伐他汀治疗的基础上miR-146a表达的减少导致脑缺血-再灌注损伤后梗死体积、神经功能缺损及NSE释放的增加。其次，当组织miR-146a表达减少后IRAK1及TRAF6蛋白的表达和NF-κB蛋白核转位增加，同时炎症因子释放也明显增多。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 作者贡献声明所有作者均参与设计、试验、写作与修改。
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