在脓毒症中，入侵的病原体可以引起机体免疫失调，从而形成一种以持续过度炎症和免疫抑制为特征的病理综合征^[1]。主要表现为淋巴细胞减少和未成熟中性粒细胞增多^[2]。在过去40年里，严重脓毒症的发病率大幅增加^[3]。美国的一项研究发现，2017年全球脓毒症发病率估计为4870万例，与脓毒症相关的死亡人数为1.1亿人，占全球死亡人数的19.7%^[4]，降低脓毒症发病率及病死率并改善患者的长期预后，是急危重症医学面临的一大挑战^[5]。近年来，越来越多的研究提示NETs在脓毒症及其相关的功能障碍中发挥着重要的作用。NETs是一把双刃剑，一方面具有杀菌活性，局限感染灶，当机体被细菌、真菌等侵入时，这些胞外结构能够诱捕致病微生物，防止其扩散，并保证高浓度的局部抗菌药物降解毒力因子，使捕获及杀灭病原微生物变得容易^[6]。但是目前在临床研究中表明，NETs本身含有大量蛋白酶和抗菌肽以及组蛋白，可以直接损伤内皮细胞和上皮细胞。同时NETs的形成，也伴随着大量胞内和核内自身抗原的暴露，当NETs大量形成或清除不及时，可诱导机体产生众多的自身抗体。这些抗体一旦被激活，往往表现出超敏表型，在局部和全身发挥有害作用^[7]，NETs控制病原的积极作用被促炎作用所抵消。不受管制的NETs对脓毒症诱导的多器官损害有显著影响，包括动脉低血压、低氧血症、凝血功能障碍、肾脏、神经系统和肝功能障碍。针对NETs的过度产生和不恰当的分解的调节在对抗脓毒症引起的多器官衰竭方面具有重要的治疗价值^[8]。因此，干预NETs的过度释放将会有效地预防脓毒症中与NETs有关的器官损伤^[9]。

1 中性粒细胞胞外陷阱 1.1 中性粒细胞胞外陷阱概述

NETs是Volker-Brinkmann等^[10]在2004年应用佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)等物质刺激中性粒细胞后发现一种由细胞内释放到细胞外的DNA网状结构，其释放主要通过一种不同于凋亡和坏死的细胞死亡途径, 称为中性粒细胞的炎性细胞死亡方式（以下称为NETosis）^[11]。NETs是中性粒细胞在受到病原体、促炎因子等刺激时主动将核内和胞内成分释放出来形成的由DNA和组蛋白为骨架并由一组中性粒细胞颗粒蛋白修饰，如抗菌肽、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）^[12]和中性粒细胞弹性酶（neutrophil elastase, NE）等组成的具有杀菌作用的细胞外网状结构^[10]。研究表明，NETs的组成因刺激因素的不同而不同，但NETs的差异性组成以及如何影响NETs功能仍有待研究^[13]。NETs可在多种疾病中发挥作用，包括一些感染性疾病，自身免疫病（如类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，白塞病等），自身炎症性疾病（如痛风，炎症性肠病），代谢性疾病（如2型糖尿病，肥胖），癌症以及脓毒症等疾病^[14]。

1.2 中性粒细胞胞外陷阱的调节

NETs的形成是由受体-配体结合事件触发的，并受一系列细胞内信号通路的调控。中性粒细胞上的受体是介导NETosis的关键。触发NETosis的受体主要有：

（1）模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）: ①Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）作为细胞第一道防线^[15]，中性粒细胞主要通过TLRs识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，从而触发对入侵病原体的反应^[6]。当TLRs激活时导致ROS生成、脱颗粒、NETs形成和细胞因子产生^[16]；②NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）是细胞溶质受体，为抵抗病原体入侵提供第二道防线，研究表明，NOD1和NOD2，可以时间依赖性的方式激活中性粒细胞可以诱导产生强烈的NETosis^[17]；③C型凝集素受体（C-type lectin receptors，CLRs)可以直接识别微生物膜聚糖，通过触发中性粒细胞的炎症细胞因子分泌、NETs形成和抗菌反应来激活固有免疫^[18]。

（2）补体受体（complement receptors，CRs)：最近的研究证明了补体系统在NETs介导的自身免疫性疾病中的病理生理学重要性。最常见的促中性粒细胞NETs释放的CRs是CR1、CR3、CR4和CR5^[6]。烟曲菌和金黄色葡萄球菌通过与CR3相互作用，激活下游NOX诱导NETs形成^[19-20]。除了细菌之外，中性粒细胞还可以通过CRs识别一些病毒。在汉坦病毒中，CR3、CR4通过活性氧依赖途径从而形成NETs^[21]。根据最新数据，导致新型冠状病毒（COVID-19）的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）通过与补体C3相互作用触发补体激活，从而产生C3a、C5a和sC5b-9。随后，C3a可能激活血小板，而C5a和血小板衍生的凝血酶可以诱导中性粒细胞组织因子（tissue factor, TF）的表达并且释放携带TF的NETs^[22]。

（3）趋化因子受体（chemokine receptors, CXCR）：趋化因子受体是七种跨膜G蛋白偶联受体，被认为是炎症期间募集中性粒细胞的最关键介质。研究表明，在几种趋化因子受体中，CXCR1、CXCR2和CXCR4参与了NETs的形成^[6]。

（4）其他中性粒细胞受体：研究证明，在COVID-19的病理生理过程中，血管紧张素转换酶2与人跨膜蛋白酶丝氨酸2同时与SARS-CoV-2的S蛋白相互作用，帮助SARS-CoV-2进入宿主细胞并诱导肽精氨酸脱亚胺酶-4 (peptidylarginine deiminase 4, PAD4)依赖性NETosis，导致与过度炎症反应相关的致命呼吸衰竭^[23]。钙信号是一种普遍的细胞内信使，在中性粒细胞作用发挥中起着关键的作用，如促炎功能的调节、NETs的形成和细胞因子的分泌^[24]。细胞内Ca²⁺浓度能够诱导PAD活化，在NETs的形成中起着关键的作用^[6]。在NETs释放的最后阶段，中性粒细胞质膜破裂需要独立于MPO、NE和PAD4的天冬氨酸蛋白水解酶-11（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-11, caspase-11）和GSDMD（gasdermin D）^[25]。

1.3 中性粒细胞胞外陷阱的分型

目前研究提示NETs有三个关键的机制：suicidal NETosis、vital NETosis和noncanonical NETosis。在suicidal NETosis和noncanonical NETosis中，在细胞破裂时发生NETs挤出，这一途径伴随着细胞的死亡。而在vital NETosis中，NETs从中性粒细胞中被排出，而中性粒细胞可以继续执行细胞迁移等细胞功能^[26]。

Suicidal NETosis最初是在高剂量的PMA刺激多核中性粒细胞的反应中被观察到，其发生过程被称为依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase, NOX）的细胞死亡过程。这个过程主要是受体的激活增加了细胞内Ca²⁺，刺激了蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）和NOX的活性，导致ROS的形成。在ROS的作用下, 激活的MPO不仅参与染色质的解聚和核膜破裂，形成的蛋白质和DNA作为NETs的主要组件，进一步激活NE，促进NE从细胞质转移到到细胞核, 裂开染色质并将其释放到细胞质中^[26]。在这之后, 核膜破裂, 导致去致密化的染色质释放到胞质，然后通过GSDMD孔或GSDMD驱动的膜撕裂被排出到细胞外空间，导致中性粒细胞死亡^[27]。在这一过程中，中性粒细胞经历了以下连续的形态学改变：(1)细胞核的典型分叶结构消失；(2)核膜和颗粒膜变得可渗透；(3)组蛋白通过剪切和（或）瓜氨酸化失活，导致染色质扩张到胞质中；(4)染色质与颗粒物质混合；(5)内膜的缺失导致胞质细胞器的消失；(6)质膜破裂, NETs被释放到细胞外空间^[26]。

相对于suicidal NETosis途径，当特定细菌、细菌产物、toll样受体激活的血小板或补体蛋白刺激时，NETs会通过vital NETosis快速释放^[28]，这一过程与NOX活性无关。在这一途径中，vital NETosis的主要特征是Ca²⁺激活的PAD4激活，瓜氨酸化的组蛋白H3激活，并在MPO和NE的合作下参与染色质去致密化。接着，细胞核失去经典的小叶形状，去致密的染色质被排出形成NETs。在这种情况下，DNA、颗粒蛋白和组蛋白的释放伴随着囊泡的形成和外源性分布而发生，因此细胞仍然是活着的，具有执行细胞迁移等细胞功能的能力^[29-31]。Vital NETosis的主要的形态学特征是组蛋白瓜氨酸化、核泡化和核泡向质膜的囊状运输，其中染色质外化而不渗透质膜^[32]。

Noncanonical NETosis这一途径依赖于非典型炎症小体的细菌感应，导致含半胱氨酸的caspase-4/11和GSDMD驱动的NETs形成。非典型炎症小体是胞质革兰氏阴性细菌的传感器，包括小鼠caspase-11或人类caspase-4/5^[33]。感染革兰氏阴性菌的人和鼠的中性粒细胞通过细胞死亡途径死亡并挤压出NETs，表现出NETosis的特征，包括核解聚、DNA挤压、DNA-MPO共定位和组蛋白瓜氨酸化^[25]。中性粒细胞的NETs形成需要细胞焦亡的参与，通过caspase-4/11和GSDMD来执行，但独立于NE或MPO进行。GSDMD-p30孔靶向多个中性粒细胞膜，介导颗粒和核膜的渗透，并最终使质膜破裂^{[25, 27]}。Noncanonical NETosis抑制细菌在中性粒细胞细胞质中的停留，并阻止体内微生物的传播^[25]。因此，noncanonical NETosis自身介导宿主防御，可能是通过移动细菌，使其能够被新招募的中性粒细胞破坏^[26]。

2 中性粒细胞胞外陷阱在脓毒症中的作用

NETs的形成可诱导器官损伤并加重脓毒症的严重程度，其通过调节炎症反应、诱发凝血功能紊乱、介导组织损伤等多种途径参与脓毒症发病。

2.1 调节炎症反应

虽然NETs通过抑制细菌的生长和传播来保护宿主，但在脓毒症过程中，加重NETosis可能对宿主有害。在脓毒症中，PAMP与巨噬细胞上的PRR相互作用，激活NF-κB，导致转录和翻译水平上损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）表达增加。这些细胞内的DAMPs通过凋亡、坏死、外泌体介导以及炎症小体介导GSDMD激活导致膜孔形成增加等途径被释放到细胞外^[34]。这些DAMPs又可以识别周围中性粒细胞上的PRR，激活PAD4、GSDMD促进NETs的形成。NETs成分如H3、MPO或DNA可进一步激活免疫细胞和内皮细胞，释放更多的DAMPs来增加炎症级联^[35]。

DAMPs介导的信号可促进巨噬细胞和其他免疫细胞产生促炎细胞因子和趋化因子。这又导致大量中性粒细胞浸润到组织中。被激活的中性粒细胞产生ROS、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和含有有毒分子的NETs，导致脓毒症的组织炎症和损伤。NETs及其组分，特别是组蛋白，也可进一步放大炎症过程，诱导内皮细胞激活，通过破坏黏附连接促进内皮屏障功能障碍，从而介导微血管渗漏^[36]。

2.2 诱发凝血功能紊乱

脓毒症患者常出现凝血功能障碍，激活的白细胞与血小板和血浆凝血因子在先天免疫反应中的直接相互作用，导致免疫血栓的形成。在脓毒症中，NETs的释放已经成为中性粒细胞驱动血栓形成的主要因素。其主要通过中性粒细胞与血小板的相互作用，导致血管内皮细胞的功能损伤，并且NETs为纤维蛋白沉积和血小板包埋以及随后的活化提供了支架，最终形成免疫血栓，不断促进微循环障碍的发生^[37]。研究发现，补体和组织因子富集的NETs是COVID-19导致的脓毒症免疫凝血性血栓形成的关键驱动因素^[22]。

Zhang等^[38]也发现了一种凝血酶-血小板- NETs轴，它有助于脓毒症相关肺损伤中的血栓形成。当脓毒症介导的ARDS发生时，中性粒细胞被激活，然后在肺血管中形成富含TF的NETs，导致凝血酶生成，血小板被凝血酶激活，然后与中性粒细胞相互作用，形成TF富集的NETs。所有这些因素由此形成恶性循环，导致大量血栓形成^[38]。研究表明，在PAD4缺陷小鼠(这些小鼠的NETs产生受损)中通过输注脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)去除NETs，可以导致血管内凝血酶活性显著降低，血小板聚集减少，微血管灌注改善。NETs诱导的血管内凝血依赖于NETs中组蛋白H4、血小板和无机多聚磷酸盐释放之间的协同作用。有研究人员提出，阻断NETs诱导的凝血功能障碍后，脓毒症小鼠的微血管灌注显著改善，全身血管内凝血和内脏损伤标志物明显减少。综上所述，动态的凝血酶-血小板- NETs轴促进脓毒症的血管内凝血和微血管功能障碍^[39]。也有研究表明，NETs形成增加也与脓毒症患者DIC发生率和病死率显著相关，表明了这与自噬途径有显著关系^[40]。

2.3 介导组织损伤

在脓毒症中，游离循环组蛋白能够破坏细胞膜的完整性，介导细胞毒性。研究表明，尽管中性粒细胞和NETs不是脓毒症中游离组蛋白的直接来源，但是NETs的组蛋白在脓毒症中介导的多器官损伤的细胞毒性中起核心作用^[13]。例如，过度的NETs可以直接损伤或者杀死肺真菌感染的上皮细胞和输血相关的急性肺损伤的内皮细胞。NETs也与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌脓毒症时的肝损害有关^[13]。研究发现，在小鼠体内，外源加入组蛋白可导致中性粒细胞边缘化、内皮空泡化、肺泡内出血和大、微血管血栓形成。高水平的细胞外组蛋白对上皮细胞和内皮细胞均有细胞毒性^[41]。然而，细胞外组蛋白的毒性作用机制尚不完全清楚。据报道，带正电的组蛋白可与质膜上带负电的磷脂结合，导致跨膜电导增加，膜破裂，最后导致钙内流^[42]。

2.4 中性粒细胞胞外陷阱与自噬

Remijsen等^[43]研究发现自噬与NETs相互作用，中性粒细胞的胞内染色质去致密化和NETs的形成是自噬和超氧化物产生的次生过程。在完整的中性粒细胞中，自噬和NOX2依赖的染色质去致密化以及caspases的抑制可能有助于功能性NETs的产生^[43]。自噬介导的NETs不仅引起炎症和组织损伤，还可导致细胞衰老、恶性转化和细胞死亡，也在宿主中对病原体清除和免疫防御发挥有益作用。自噬作为溶酶体吞噬体的替代降解平台参与病原体的清除，其参与了膜结合蛋白和细胞质蛋白的外化，从而影响了NETs形成过程。自噬还可能在抑制呼吸爆发、阻断细胞骨架动力学和染色质去致密化以及诱导NETs形成阶段组蛋白瓜氨酸化中发挥作用^[44]。PI3K-AKT-mTOR轴连接自噬和NETs诱导^[44]，Itakura等^[45]在刺激中性粒细胞之前抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR），观察到自噬和NETs的形成的增加。

Konstantinos Kambas等^[46]等报道了自噬小体中包含的TF与NETs的细胞外传递有关，而抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)信号转导或中性粒细胞的核内体酸化可阻断NETs的释放和TF的转运。该研究表明，脓毒性炎症环境以自噬依赖的方式诱导NETs释放^[47]。Wang等^[48]发现p38调节活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase, PRAK)可以控制ROS释放，维持mTOR信号，限制自噬过度激活，防止NETs形成过程中的细胞凋亡。在病原菌胁迫下，PRAK可能是调控细胞凋亡与NETs形成平衡的关键调控因子。合理的PRAK-ROS可以通过激活mTOR-自噬来抑制细胞凋亡，并留下一个启动NETs形成的机会。PRAK功能障碍可导致ROS过量，ROS促进自噬形成并最终转化为凋亡，过度的自噬最终会终止NETosis^[48]。

3 应用展望

脓毒症的预后取决于早期诊断和干预^[49]。多器官功能障碍是脓毒症进展过程中最严重的结果，与预后密切相关^[50]。过度的NETs在脓毒症器官衰竭的发展中起关键作用。因此，针对NETs释放的干预可能会有效地预防与该疾病相关的基于NETs的器官损伤，目前通过对于NETs在脓毒症中作用的研究，可以通过靶向NETs治疗为脓毒症的治疗寻求新的靶点。

Silva等^[9]证明了用双硫或基因缺失抑制GSDMD可消除NETs的形成，减少多器官功能障碍和脓毒症的致死率。因此GSDMD是改善脓毒症治疗的一个治疗靶点，双硫磷可以通过抑制GSDMD作为一种新的治疗方法^[9]。Mohammed等^[51]体外和体内研究发现，VitC是脓毒症中NETs形成的一种新的调节因子。其在脓毒症中具有保护作用，可以防止产生过多的NETs^[51]。Gollomp等^[52]认为稳定NETs和隔离有毒的NETs降解产物（NETs degradation products，NDPs）可以加强脓毒症的治疗。并且发现一种血小板第4因子（platlet factor 4，PF4），与NETs结合后可以使NETs结构更为紧密，增加机体对DNase I的抵抗力。此外，在动物试验中发现PF4还可以增强NETs介导的细菌捕获，减少NDPs的释放，提高脓毒症小鼠模型的预后。KKO是一种与PF4-NETs结合的单克隆抗体，可进一步增强机体对DNase I的抵抗力，但该抗体的Fc段可激活免疫反应，增加血栓风险。研究人员现已经开发出一种Fc-修饰的KKO，不会诱导任何负性预后。采用该种抗体可放大PF4的效应，减少NDP释放和细菌扩散。该新型靶向NETs的治疗方法或可用于改善脓毒症患者预后。

总之，未来可考虑将如何调节NETs的形成作为切入点对脓毒症进行有效、靶向性强的治疗。NETs的发现为丰富脓毒症的分子机制、生化途径，开发更多的靶向性治疗方式的研究建立了新的平台，具有重要的临床意义。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突