2023, Vol. 32
2. 中日友好医院江西医院，南昌 330006
2. China-Japan Friendship Jiangxi Hospital, Nanchang 330006, China
脓毒症脑损伤（sepsis encephalopathy, SE）是由脓毒症导致的急性弥漫性脑损伤，也称脓毒症脑病，发病率为8%~70%[1]，以行为、认知、觉醒和意识改变为临床特点，脑组织出现炎症反应而缺乏中枢神经系统感染证据。在无中枢神经系统感染的脓毒症动物模型及人体解剖中均已证实小胶质细胞的活化[2-3]，即小胶质细胞从静止型转化为促炎型（M1型），释放氧自由基、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白介素（interleukin, IL）-1β等导致血脑屏障的破坏、微循环障碍、神经细胞凋亡[4-5]，进而导致脑功能受损。
外泌体是细胞分泌的直径在30~150 nm的小囊泡，可携带DNA、lncRNA、mRNA和蛋白质等传递生物信息[6]。干细胞来源的外泌体在脑外伤、多发性硬化、阿尔兹海默症等中枢神经系统疾病中展现了强大的炎症抑制及促神经再生能力[7-9]，并且外泌体能够通过细胞膜和血脑屏障，通过外周给药可相对容易到达脑组织。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）由体细胞经过转化因子重编程而来，具有胚胎干细胞特性和功能，这一技术极大程度地解决了干细胞获取困难、伦理限制、个体自身的问题，因此iPSC及iPSC的外泌体（iPSC exosome, iPSC-Exo）成为再生医学领域的研究热点[10]。iPSC-Exo能显著抑制机体炎症反应，但iPSC-Exo对脓毒症导致的脑组织炎症反应是否有类似的作用未见报道。
本团队利用SE患者尿液细胞体外诱导为iPSC，将其作为获取大量外泌体的来源细胞，探讨iPSC-Exo对LPS刺激的小胶质细胞炎症反应的影响及治疗SE的新思路。
1 材料与方法 1.1 细胞、试剂和仪器脓毒症患者尿液来源iPS细胞株由本课题组实验室提供[医学研究伦理批准号：（2021）医研伦审第8-013号][11]；人类永久性小胶质细系HMO6（君礼生物科技，上海，中国）；Essential 8培养基及One-Step RT-PCR试剂盒（赛默飞世尔科技，美国）；超高灵敏流式检测装置（福流生物科技公司，厦门，中国）；JEM-1010透射电子显微镜（电子株式会社，日本）；Alix、TSG101、CD63、GM130及GAPDH抗体（Abcam，美国）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥公司，北京，中国）；酶联免疫吸附试剂盒（eBioscience，美国）。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养将本实验室之前建立[11]的人源iPSC进行复苏并于Essential 8培养基中培养，每4~5 d传代1次。HMO6细胞系培养于含0.5%青霉素/链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基。所有细胞均在37 ℃、5%CO2的湿润空气下培养。
1.2.2 外泌体的提取每天更换iPSC的培养基，第2天开始收集细胞培养基上清液，4 ℃、300 g离心10 min，取上清液，弃细胞沉淀，2 000 g离心20 min除去细胞碎片，收集上清经0.22 μm过滤器过滤，过滤液4 ℃100 000 g离心90 min，弃上清液，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）重悬后于4 ℃、100 000 g离心90 min，沉淀用PBS重悬后转移至1.5 mL EP管中，-80 ℃保存备用。
1.2.3 外泌体的鉴定外泌体悬液于37 ℃解冻，4%多聚甲醛固定1 h，取10 μL外泌体悬液滴于炭支持膜的铜网并孵育10 min，PBS洗净多聚甲醛，滤纸吸干液体，滴加2%醋酸双氧铀染液（5 μL），静置30 s后滤纸吸干负染液，室温下干燥，透射电镜观察外泌体形态并拍摄电镜照片。使用超高灵敏流式检测技术（high sensitivity flow cytometry, HSFCM）检测iPSC-Exo的粒径分布和浓度，按照说明[12]进行操作，用200 nm控制珠进行校准，作为颗粒浓度及粒径分布的参考，PBS溶液校零，采用软件（NanoFCM Profession V1.17）进行分析。免疫印迹法检测iPSC和外泌体的表面蛋白（CD63、Alix、TSG101和GM130），即RIPA裂解液提取外泌体总蛋白及iPSC总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯法确定各组蛋白的浓度。提取的蛋白样品经电泳分离后转移至PVDF膜。牛血清白蛋白阻断1 h，分别一抗稀释液（Alix、TSG101、CD63、GM130）于4 ℃缓慢震荡，孵育过夜。用含0.1% Tween-20的PBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温震荡孵育1 h，再次洗涤，置化学发光成像仪下显影。
1.2.4 HMO6细胞处理及分组将HMO6细胞随机分为对照组和干预组（LPS组），LPS（100 ng/mL）刺激人小胶质细胞系HMO6细胞建立炎症反应模型[13]，根据外泌体浓度梯度分为4组，即LPS+PBS组、LPS+iPSC-Exo 105组、LPS+iPSC-Exo 106组、LPS+iPSC-Exo 107组，对照组将LPS等量替换为PBS。实验重复10次。培养24 h后检测各组巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein 2，MIP2）、TNF-α、IL-1β、IL-6和丙二醇（propylene glycol, MDA）水平。
1.2.5 MDA测定分离细胞于离心管中，超声波破碎细胞，8 000 g 4 ℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。将盐酸及硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）混合，1 mL样品加入2 mL该溶液，50 ℃水浴加热40 min以溶解TBA，冰浴冷却，1 000 g离心10 min，吸取上清液于波长535 nm处读取吸光度。计算MDA的浓度：C=A/1.65×105，其中C表示浓度，A表示吸光度。
1.2.6 酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定炎症因子蛋白浓度根据ELISA试剂盒说明测定细胞培养基上清液的MIP2、TNF-α、IL-6和IL-1β水平。将100 μL的上清液、稀释后的标准品、质控品和稀释缓冲液（空白对照）加入酶反应孔，37 ℃孵育2 h后洗涤，加入100 μL生物素标记抗体，继续孵育1 h。洗涤后加入HRP-标记链霉亲和素，避光孵育30 min。加入100 μL底物液显色，继续孵育10 min，加入终止液，于波长450 nm处读取吸光度。
1.2.7 RT-qPCR检测细胞中mRNA的表达收集细胞，按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，测定样品纯度与浓度，用Primer Premier 5. 0软件设计引物，序列见表 1。按One-Step RT-PCR试剂盒步骤操作获得cDNA，以GAPDH作为内参，采用ABI Vii7系统进行实时荧光定量PCR扩增目的基因，反应条件为95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，最后延伸10 min。目的基因的相对表达用2-ΔΔCT法分析。
| 基因 | 引物序列（5’-3’） | |
| MIP2 | 正向 | CTGCCAGTGCTTGCAGACCC |
| 反向 | TTAACCATGGGCGATGCGGG | |
| TNF-α | 正向 | CAAAGTAGACCTGCCCAGAC |
| 反向 | GACCTCTCTCTAATCAGCCC | |
| IL-1β | 正向 | AAAAGCTTGGTGATGTCTGG |
| 反向 | TTTCAACACGCAGGACAGG | |
| IL-6 | 正向 | GTGTGAAAGCAGCAAAGAGGC |
| 反向 | CTGGAGGTACTCTAGGTATAC | |
| GAPDH | 正向 | TGACTTCAACAGCGACACCCA |
| 反向 | CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA | |
| 注：MIP2为人巨噬细胞炎性蛋白2，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL为白介素，GAPDH作为PCR反应系统内参 | ||
统计分析使用GraphPad Prism 8软件进行。服从正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，相同外泌体浓度下，组间比较采用单因素方差分析及SNK-q检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 iPSC-Exo的鉴定透射电镜图像显示iPSC-Exo具有球形膜结构（图 1A）。透射电镜图像显示外泌体直径约71.12 nm。利用HSFCM评估外泌体的数量及尺寸分布，结果显示提取物平均直径为（74.66±15.60）nm（图 1B），浓度约为2.98×1010/mL。免疫印迹分析证实提取物阳性高表达外泌体标记蛋白（CD63、Alix和TSG101），无高尔基体蛋白GM130表达（图 1C）。以上数据表明成功从iPSC培养基中提取和纯化了外泌体。
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| A为透射电镜示iPSC-Exo具有球形膜结构，标尺：50 nm；B为HSFCM分析iPSC-Exo的粒径分布；C为免疫印迹分析证实iPSC-Exo阳性高表达外泌体标记蛋白（CD63、Alix和TSG101），无高尔基体蛋白GM130的表达，GM130即内参 图 1 人iPSC-Exo的表征 Fig 1 Characterization of human iPSC-Exo |
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为确定来自iPSCs的外泌体是否影响LPS诱导的小胶质细胞的炎症反应，本团队使用永生化小胶质细胞HMO6细胞系，LPS处理以构建细胞炎症反应模型。如图 2A所示，相同外泌体浓度条件下，LPS组MDA的浓度较对照组明显增加（均P < 0.01），并且随外泌体浓度逐渐增加，LPS组MDA浓度逐步下降（均P < 0.01），仅加入iPSC-Exo（对照组）没有明显改变HMO6细胞内MDA的浓度，表明iPSC-Exo可改善LPS导致的细胞氧化应激损伤。RT-qPCR结果（图 2B）示，LPS处理后，细胞内关键炎症因子（MIP2、TNF-α、IL-1β和IL-6）mRNA表达水平及蛋白浓度均明显升高（均P < 0.01），表明LPS导致小胶质细胞产生迅速而强烈的炎症反应。同时随外泌体浓度增加，上述炎症因子mRNA表达水平呈下降趋势（MIP2、TNF-α、IL-1β和IL-6，均P < 0.01）。对上清液相应炎症因子浓度测定示炎症因子浓度变化趋势与相应mRNA基本一致（LPS+iPSC-Exo 107组TNF-α浓度低于LPS+iPSC-Exo 106组，LPS+iPSC-Exo 106组IL-6浓度低于LPS+iPSC-Exo 105组，但差异无统计学意义；余差异均有统计学意义，P < 0.05，图 2C）。以上结果证实，iPSCs来源的外泌体可以剂量依赖性地改善LPS诱导的HMO6小胶质细胞的炎症反应。
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| A为TBA法检测HMO6细胞内MDA浓度；B为ELISA法检测上清液细胞因子（MIP2、TNF-α、IL-1β和IL-6）的蛋白水平；C为RT-qPCR分析细胞因子（MIP2、TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA表达情况；与对照组比较，a P < 0.01；在LPS组间，与LPS+PBS组比较，b P < 0.01；与LPS+iPSC-Exo 105组比较，c P < 0.05；与LPS+iPSC-Exo 106组比较，d P < 0.05 图 2 iPSC-Exo可剂量依赖性地改善LPS诱导的HMO6小胶质细胞的氧化应激及炎症反应 Fig 2 iPSC-Exo dose-dependently ameliorated LPS-induced oxidation and inflammatory response in HMO6 microglia |
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外泌体携带母细胞的生物大分子穿梭在机体各细胞间，通过膜表面信号识别作用传递生物信号，或与靶细胞融合，将携带的生物大分子传递至细胞内，实现遗传信息的横向传递、调节靶细胞的生物功能。外泌体的形成过程较为复杂，以胞膜内陷形成早期内体开始，细胞通过多种转运机制将特定的mRNA、lncRNA、microRNA、蛋白质、脂质等物质转运入内体，并逐步形成晚期内体/多泡体，最终与质膜融合并释放外泌体[14-15]。间充质干细胞（mesenchymal stromal cell, MSC）作为一类成体干细胞，具有促进组织再生及免疫调节能力，干细胞移植已广泛用于血液系统疾病的治疗。然而近年发现在许多情况下MSC带来的临床获益可能是MSC来源的外泌体介导的，MSC本身无治疗意义[16-19]。iPSC技术的出现克服了MSC数量有限、取材有创、伦理问题等缺点，iPSC-Exo可抑制缺血缺氧组织炎症反应、促进血管再生、抑制纤维化等，被广泛用于急性心肌梗死、肝脏缺血-再灌注损伤、肢体外伤的治疗研究中[20-21]。另外，相比于干细胞，外泌体更易保存，无恶变可能，以及较低的免疫原性，同时外泌体表现出对损伤炎症组织明显的亲和性[22]，因此外泌体被视为干细胞疗法的潜在替代方案。而人尿液细胞来源的iPSC则具有自体无创来源、体外扩增能力强、能获取大量外泌体的特点，故本课题组利用患者尿液细胞体外诱导得到iPSC，通过低温超速离心法分离外泌体，探究iPSC-Exo调节中枢神经系统炎症反应的可能。
SE急性期的病死率居高不下，幸存患者的脑功能损害也常常不可逆，高达45%的SE幸存者在1年后存在认知缺陷[23-24]，2019年国内一项回顾性研究报告的比例更高[25]。过去5年研究人员进行了大量关于SE的发病机制及干预措施的试验，但仍缺乏针对SE有效的治疗手段[26]。小胶质细胞作为中枢神经系统固有的巨噬样免疫细胞，维持着中枢神经系统免疫稳态，在SE的发生发展也起着核心作用[4-5]。当脓毒症引发全身炎症反应时，血脑屏障受损，外周促炎因子进入中枢神经系统并激活小胶质细胞及星形胶质细胞，炎症损伤因子在中枢神经系统大量产生，神经细胞代谢紊乱促进细胞间液谷氨酸盐的累积，神经兴奋性增加[27-28]，导致中枢神经系统微观结构改变和功能异常。M1型小胶质细胞是促炎因子的主要来源，因此抑制小胶质细胞过度激活，减少炎症介质失控性释放是防治SE的重要措施[4, 29]。
干细胞来源的外泌体在神经炎症反应中的应用价值近几年逐渐得到重视。腹腔注射LPS诱导新生大鼠系统性炎症反应，MSC-Exo明显改善炎症导致的大脑急性脱髓鞘改变以及成年后的认知功能障碍[30]。鼻内滴注人源iPSC分化而来的神经干细胞的外泌体可改善癫痫持续状态大鼠的海马区炎症状态[31]。创伤性脑损伤后的急慢性神经炎症反应二次打击神经细胞、阻碍神经功能恢复，静脉注射MSC-Exo明显抑制损伤脑组织的炎症反应、促进血管及神经再生，改善感觉、运动及认知功能[32]。MSC-Exo通过激活PI3K/Akt信号通路逆转缺血缺氧导致的神经胶质细胞凋亡[33]。干细胞受某些特定刺激后分泌的外泌体携带大量抗炎因子、调控基因表达的非编码RNA，具有炎症抑制、促进神经系统结构和功能恢复的潜能[34]。IFN-γ刺激后MSC分泌的外泌体（IFNγ-Exo）促进中枢神经系统Treg细胞的数量增加、抑制炎症及脱髓鞘反应，与IFNγ-Exo携带的抗炎mRNA、miRNA、炎症抑制分子有关，如吲哚-2, 3-双加氧酶mRNA、miR-146b、热休克蛋白70[9]。低氧诱导的MSC-Exo通过传递miR-216a-5p促进小胶质细胞向M2型转变[35]。Ⅱ型糖尿病大鼠来源的MSC-Exo改善急性缺血性脑卒中后的脑组织的病理改变或与外泌体中的miR-9靶向的脑细胞ABCA1通路的激活有关[36]。利用外泌体可跨越血脑屏障的特性，外泌体也被作为药物载体提高抗炎药的渗透性[31, 37]。本实验将脓毒症患者尿液细胞来源的iPSC分泌的Exo与LPS诱导的小胶质细胞炎症反应模型共培养，发现iPSC-Exo可以改善HMO6细胞氧化应激损伤、减少LPS刺激下的炎症因子，这与MSC-Exo对活化小胶质细胞的炎症抑制作用一致[35]，并且iPSC-Exo浓度越高炎症抑制作用越强。并且本团队前期研究工作发现将SE患者尿液诱导形成的iPSC进一步分化为神经元，这类神经元在相同应激下更易表现出神经元退行性变，表明SE患者来源的iPSC保留了某种改变。
本实验初步验证了iPSC-Exo的炎症抑制作用，但未进行iPSC-Exo抑制炎症反应的最佳浓度，课题组将在后续实验中分析脓毒症患者尿液细胞来源的iPSC-Exo与正常人体细胞所分泌的外泌体非编码RNA的表达差异以及iPSC-Exo最佳浓度的探索。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 马礼秀：实验操作、统计学分析、论文撰写；肖策：实验操作、论文撰写；章智哲：实验操作、论文撰写；詹以安：研究设计、论文修改
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