2023, Vol. 32
脓毒症是由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，据统计2017年全球有4 890万例脓毒症事件，1 100万例脓毒症相关死亡，占全球死亡总数的19.7%[1-2]。探索脓毒症的发病机制及如何降低病死率尤为重要。吡格列酮为噻唑烷二酮类药物中的一种，是过氧化物酶体增殖物活化受体-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ, PPAR-γ)的高亲和力外源性激动剂，临床用其来增加2型糖尿病患者机体对胰岛素的敏感性，另有研究表明其有抑制炎症反应和抗氧化的作用[3-4]。课题组前期研究发现脓毒症患者血清中微小RNA-142-3p(microRNA-142-3p, miR-142-3p)的表达升高，另有研究显示PPAR-γ可通过上调miR-142-3p来靶向调控高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)的表达。脾脏作为人体最大的免疫器官，在脓毒症发生时出现免疫细胞凋亡和组织损伤[5-7]。本研究旨在观察脓毒症小鼠不同时间点炎症因子的变化趋势及脾脏的病理学改变，探讨吡格列酮是否可通过调节miR-142-3p发挥抗炎作用。
1 材料与方法 1.1 动物与试剂本实验使用SPF级健康雄性BALB/c小鼠60只，6~8周龄，体重18~22 g，购于扬州大学实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK(苏)2017-0007]，在宁波大学实验动物中心饲养[许可证号：SYXK(浙)2013-0191]，采用光照/黑暗各12 h适应性饲养1周后进行实验。本实验符合动物伦理学标准，经宁波大学实验动物伦理委员会批准。
LPS购自美国Sigma公司; 吡格列酮购自杭州中美华东制药有限公司; 白细胞介素(interleukin, IL)-6、IL-10及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司; HMGB1试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司; 定量PCR试剂盒购自瑞士Roche公司; 特异性引物由武汉塞维尔生物科技有限公司合成。
1.2 动物模型建立与分组按随机数字表法将小鼠分成对照组(normal control group, NC组)、脓毒症模型组(lipopolysaccharide group, LPS组)和吡格列酮干预组(吡格列酮+LPS组)3组，每组20只。根据相关文献[8]，采用腹腔注射LPS 10 mg/kg制备脓毒症小鼠模型; 对照组注射等量生理盐水; 吡格列酮干预组为连续吡格列酮60 mg/kg灌胃3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，再连续吡格列酮60 mg/kg灌胃2 d[6]。实验期间允许自由进食及饮水。各组分别于建模后6 h、12 h、24 h、48 h随机选5只小鼠取血和留取脾脏标本。
1.3 检测指标及方法 1.3.1 标本采集分别于6 h、12 h、24 h、48 h取小鼠眼眶血，室温下自然放置1 h，待血液凝固后，3000 r/min(离心半径10 cm)离心15 min，吸取上层血清分装后置-80 ℃冰箱保存以备相关指标检测。所有小鼠在取血后均采用颈脱位法处死，留取新鲜脾脏组织样本，部分脾脏组织用4%甲醛溶液固定，以备病理学观察; 部分脾脏组织于-80 ℃冰箱保存，用于相关指标检测。
1.3.2 酶联免疫吸附试验检测IL-6、IL-10、TNF-α和HMGB1的表达水平取冻存的小鼠血清标本，解冻后按照试剂盒说明书进行，应用酶标仪(Thermo Multiskan MK3)计算其相对浓度，样本设置2复孔。
1.3.3 实时荧光定量反转录-聚合酶链反应检测miR-142-3p和PPARγ的表达取冻存组织约100 mg，采用TRIzol法提取脾脏组织总RNA，反转录后用定量PCR试剂盒检测miR-142-3p和PPARγ的表达。
PCR扩增：95℃预变性10 min; 循环(40次)，95 ℃，15 s至60 ℃，60 s; 溶解曲线60 ℃至95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。对每个样本设定同样的循环阈值基线和截点，每个样本设置3复孔。特异性引物由武汉塞维尔生物科技有限公司合成。以内参RNA U6为miRNA定量参照，GAPDH为PPARγ的定量参照，用2–△△CT法计算各目标的相对表达量。miR-142-3p正向引物5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3’，反向引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATAAA-3’; U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT -3’。PPARγ正向引物5’- TCAAGGGTGCCAGTTTCGATCCGTAGAAGC-3’，反向引物5’-CTGCAGCAGGTTGTCTTGGATGTCCTC-3’; GAPDH正向引物5’-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3’，反向引物5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3’。
1.3.4 脾脏组织病理学观察取4%甲醛溶液固定的脾脏组织，经乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度5 μm)、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色后，光镜下观察。
1.4 统计学方法使用SPSS 20.0软件进行数据分析，正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示，三组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，正态分布资料相关性分析采用Pearson相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠不同时间点炎症因子比较与NC组相比，LPS组在6 h、12 h、24 h、48 h血清中的IL-6、IL-10、TNF-α及HMGB1均明显升高(均P < 0.001)。应用吡格列酮干预组促炎因子IL-6和TNF-α在6 h、12 h、24 h、48 h较LPS组下降，促炎因子HMGB1在12 h、24 h、48 h较LPS组下降，抑炎因子IL-10在12 h、24 h及48 h较LPS组升高(均P < 0.001)。见表 1。
| 指标 | NC组(n=20) | LPS组(n=20) | 吡格列酮干预组(n=20) | F值 | P值 |
| IL-6 | |||||
| 6 h | 11.58±2.56 | 1 664.32±42.56a | 1 050.96±54.23ab | 2 199.77 | < 0.001 |
| 12 h | 9.72±1.12 | 1 528.53±70.32a | 566.93±17.18ab | 1 689.58 | < 0.001 |
| 24 h | 7.49±0.69 | 912.19±39.48a | 449.05±20.77ab | 1 541.85 | < 0.001 |
| 48 h | 5.89±1.33 | 59.97±5.38a | 33.77±3.75ab | 245.06 | < 0.001 |
| IL-10 | |||||
| 6 h | 135.36±12.98 | 1 254.14±96.31a | 1 289.31±96.06a | 346.01 | < 0.001 |
| 12 h | 80.75±2.21 | 1 040.62±76.01a | 1 184.79±76.62ab | 463.58 | < 0.001 |
| 24 h | 58.52±6.59 | 548.42±47.48a | 706.26±54.70ab | 323.49 | < 0.001 |
| 48 h | 41.80±4.83 | 301.23±59.30a | 518.68±59.69ab | 120.35 | < 0.001 |
| TNF-α | |||||
| 6 h | 0.97±0.14 | 82.19±11.08a | 55.77±5.43ab | 169.08 | < 0.001 |
| 12 h | 0.72±0.16 | 16.39±2.76a | 8.94±0.98ab | 107.11 | < 0.001 |
| 24 h | 0.40±0.05 | 8.52±1.18a | 5.08±0.69ab | 132.9 | < 0.001 |
| 48 h | 0.36±0.06 | 6.31±1.25a | 3.91±0.51ab | 73.95 | < 0.001 |
| HMGB1 | |||||
| 6 h | 1 204.27±62.71 | 1 332.40±49.10a | 1 311.38±54.47a | 7.61 | < 0.001 |
| 12 h | 1 158.04±49.34 | 1 549.96±38.81a | 1 334.49±73.32ab | 62.03 | < 0.001 |
| 24 h | 1 175.08±51.59 | 1 906.11±33.78a | 1 582.84±50.73ab | 315.69 | < 0.001 |
| 48 h | 1 156.82±54.03 | 2 317.83±51.14a | 1 620.26±48.42ab | 650.22 | < 0.001 |
| 注：IL为白细胞介素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，HMGB1为高迁移率族蛋白B1; 与NC组同时间点比较，aP < 0.01; 与LPS组同时间点比较，bP < 0.01 | |||||
光镜下观察，NC组脾脏红白髓之间界限清晰，红髓内含有丰富的红细胞，脾窦间隙大小均匀，未见扩张，脾小结形态为形态规则的椭圆形，小淋巴细胞排列紧密，未见炎症、坏死等病理性改变。LPS组制模后6 h可见部分脾小结内小淋巴细胞数量减少，细胞排列疏松，红髓内部分脾窦间隙轻度扩张; 12 h后脾小结内大量细胞坏死，可见坏死的细胞碎片，脾小结内细胞排列疏松，脾小结结构散乱; 24 h后脾小结内细胞坏死进一步加重，局部红髓内可见炎性细胞弥散性浸润; 48 h后脾小结结构极度散乱，脾小结内小淋巴细胞大量消失，细胞排列疏松，红白髓之间界限模糊，伴有炎性细胞弥散性浸润。吡格列酮干预组制模后6 h、12 h、24 h、48 h细胞坏死程度及炎性细胞浸润较LPS组减轻。见图 1。
|
| 图 1 三组小鼠制模后不同时间点脾脏组织HE染色图(×200) |
|
|
与NC组相比，LPS组在造模后6 h、12 h脾脏中miR-142-3p和PPARγ mRNA均升高，但24 h、48 h均下降(均P < 0.01); 应用吡格列酮干预组在6 h、12 h、24 h、48 h脾脏中miR-142-3p和PPARγ mRNA均较LPS组升高(均P < 0.01)。见表 2。应用Pearson相关性分析显示，miR-142-3p和PPARγ mRNA存在正相关(r=0.916，P < 0.001)。见图 2。
| 组别 | miR-142-3p | PPARγ | |||||||
| 6 h | 12 h | 24 h | 48 h | 6 h | 12 h | 24 h | 48 h | ||
| NC组(n=20) | 1.00±0.08 | 0.99±0.07 | 1.01±0.07 | 1.00±0.06 | 1.00±0.07 | 1.02±0.08 | 1.00±0.04 | 0.99±0.07 | |
| LPS组(n=20) | 1.72±0.05a | 1.27±0.04a | 0.56±0.04a | 0.55±0.04a | 1.68±0.08a | 1.30±0.07a | 0.57±0.02a | 0.55±0.04a | |
| 吡格列酮干预组(n=20) | 2.03±0.13ab | 1.80±0.04ab | 1.56±0.03ab | 0.97±0.04b | 2.99±0.24ab | 2.62±0.20ab | 1.94±0.07ab | 1.54±0.06ab | |
| F值 | 159.07 | 320.20 | 541.48 | 140.29 | 223.16 | 219.81 | 1 157.59 | 367.91 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 注：PPARγ为过氧化物酶体增殖物激活受体γ; 与NC组同时间点比较，aP < 0.01; 与LPS组同时间点比较，bP < 0.01 | |||||||||
|
| 图 2 脾脏中miR-142-3p与PPARγ mRNA的相关性 |
|
|
应用Pearson相关性分析显示，miR-142-3p和HMGB1存在负相关(r=-0.884，P < 0.001)，见图 3。miR-142-3p与IL-6、IL-10及TNF-α存在正相关(r=0.420，P=0.007; r=0.876，P < 0.001; r=0.541，P < 0.001)。
|
| 图 3 miR-142-3p与HMGB1的相关性 |
|
|
脓毒症是威胁人类健康的重要疾病之一，由炎性因子和趋化因子等细胞因子组成的炎症网络影响着脓毒症的发生发展。在脓毒症早期，机体产生促炎因子后，抗炎因子随之产生，两者相互调节，改善炎症反应的强度，若调节失衡，将对器官、组织和细胞造成严重损失[9]。在脓毒症患儿及动物实验中均有研究揭示了细胞因子的重要性[10-11]。课题组前期研究发现在脓毒症患者中IL-6和IL-10均明显升高，但由于患者从脓毒症发生到救治时间不一致，很难明确炎症因子的发展趋势[5]，因此本实验构建了脓毒症小鼠模型，在制模后6 h、12 h、24 h、48 h分别检测IL-6、IL-10、TNF-α及HMGB1的表达，其较NC组均明显升高。应用吡格列酮干预后，促炎因子IL-6和TNF-α在四个时间点的水平均较LPS组下降，HMGB1的表达滞后，在12 h后开始下降，抑炎因子IL-10在12 h开始较LPS组表达水平升高，提示吡格列酮可减轻脓毒症小鼠的炎症强度，与既往研究结果一致[12-13]。
脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，在机体的炎症反应过程中发挥重要作用。Chung等[14]用离体猪脾脏灌注模型注射肺炎链球菌，观察到血液中的细菌完全清除，脾脏中的细菌数量增加。Dkhil等[15]在脓毒性小鼠模型中揭示了脾脏的组织学损伤及炎症反应。本研究也通过不同时间点脾脏的病理学改变验证了脓毒症急性脾脏损伤，应用吡格列酮可减轻脾脏损伤程度。
微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类长度约为18~25个核苷酸的内源性非编码单链RNA，其在炎性反应、免疫细胞分化和凋亡、免疫抑制等不同层面调控着脓毒症的发生、发展和转归[16]。miR-142-3p含有23个核苷酸，编码基因位于17q22，采用在线miRNAs靶基因预测软件TargetScan、Microrna.org和PicTar，HMGB1同时被这三个软件预测为miR-142-3p的靶基因，在脓毒症、肿瘤和骨关节炎等疾病中均发现miR-142-3p可负向调节HMGB1的表达，与本研究的结果一致[6, 17-18]。
吡格列酮可增加外周组织对胰岛素的敏感性，抑制肝糖原异生途径，是批准用于治疗2型糖尿病的第三种噻唑烷二酮药物，另外吡格列酮对PPARγ的活化作用显著，可有效调节机体炎症水平、减轻内皮细胞损伤程度，有动物研究其可减轻重症胰腺炎相关肺损伤[19]。一项回顾性研究显示，长期服用吡格列酮可减少2型糖尿病患者发生脓毒症时的病死率，推测吡格列酮对脓毒症患者有潜在的保护作用[20]。Kaplan等[4]进行吡格列酮治疗脓毒症患儿的Ⅰ期临床试验，证实了吡格列酮可有效减轻炎症反应。但吡格列酮的抗炎作用机制复杂，在脓毒症小鼠模型中发现吡格列酮通过抑制NF-κB来降低炎症反应，Gao等[21]研究发现吡格列酮可通过减少炎症因子释放及氧化应激反应来降低脓毒症大鼠的肠道损伤，Haraguchi等[22]发现吡格列酮可通过抑制细胞因子和趋化因子及髓过氧化物酶活性来提高脓毒性ApoE基因敲除小鼠的存活率[13]。Yuan等[6]通过体外实验研究揭示了PPARγ能与miR-142-3p启动子相互作用，曲格列酮可上调成熟miR-142-3p的表达。本研究也发现脓毒症小鼠脾脏中的PPARγ和miR-142-3p正相关，应用吡格列酮干预后可增加PPARγ和miR-142-3p的表达水平，减轻炎症反应。
然而，本实验也存在一些局限性，受制于研究成本，未设置miR-142-3p模拟物或抑制剂组来验证是否有类似或相反的效应。其次，未设置吡格列酮的药物剂量梯度，无法探究吡格列酮与脓毒症脾损伤的量效关系。
综上所述，本研究结果显示，吡格列酮可减轻脓毒症小鼠的炎症反应，降低脾脏损伤水平，其机制可能通过miR-142-3p来靶向调节HMGB1的表达，但吡格列酮在脓毒症患者中临床应用的安全性及有效性仍需进一步临床试验来证实。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 李洁、孙敏、董进中：实验操作、论文撰写; 叶继辉、乐健伟、王娟娟：数据收集及整理、统计学分析; 李洁、朱建华：研究设计、基金支持、论文修改
| [1] | Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3)[J]. JAMA, 2016, 315(8): 801-810. DOI:10.1001/jama.2016.0287 |
| [2] | Rudd KE, Johnson SC, Agesa KM, et al. Global, regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study[J]. Lancet, 2020, 395(10219): 200-211. DOI:10.1016/S0140-6736(19)32989-7 |
| [3] | 中华医学会糖尿病学分会, 朱大龙. 中国2型糖尿病防治指南(2020年版)[J]. 中华糖尿病杂志, 2021, 13(4): 315-409. DOI:10.3760/cma.j.cn115791-20210221-00095 |
| [4] | Kaplan JM, Zingarelli B, Krallman K, et al. Phase 1 safety and pharmacokinetic study on the use of pioglitazone in critically ill patients with sepsis: a randomized clinical trial[J]. Intensive Care Med, 2018, 44(11): 2006-2008. DOI:10.1007/s00134-018-5374-7 |
| [5] | 李洁, 孙敏, 乐健伟, 等. 微小RNA-142-3p在脓毒症患者血清中的表达及其临床意义[J]. 中华危重症医学杂志(电子版), 2018, 11(5): 310-315. DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-6880.2018.05.006 |
| [6] | Yuan ZQ, Luo GX, Li XL, et al. PPARγ inhibits HMGB1 expression through upregulation of miR-142-3p in vitro and in vivo[J]. Cell Signal, 2016, 28(3): 158-164. DOI:10.1016/j.cellsig.2015.12.013 |
| [7] | 李冲, 陈涛, 陈淼. 胍丁胺对脓毒症大鼠免疫细胞凋亡的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2021, 30(6): 708-714. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2021.06.013 |
| [8] | Wang PH, Feng ZH, Sang X, et al. Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model[J]. Food Funct, 2021, 12(20): 10263-10280. DOI:10.1039/D1FO01839F |
| [9] | 杨建钢, 杨玉彬, 刘清华. 脓毒性休克患者早期主要炎性因子水平及其临床意义[J]. 中华危重病急救医学, 2019, 31(6): 680-683. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2019.06.004 |
| [10] | Angurana SK, Bansal A, Muralidharan J, et al. Cytokine levels in critically ill children with severe sepsis and their relation with the severity of illness and mortality[J]. J Intensive Care Med, 2021, 36(5): 576-583. DOI:10.1177/0885066620912989 |
| [11] | Niu YY, Chen Y, Sun PB, et al. Intragastric and atomized administration of canagliflozin inhibit inflammatory cytokine storm in lipopolysaccharide-treated sepsis in mice: a potential COVID-19 treatment[J]. Int Immunopharmacol, 2021, 96: 107773. DOI:10.1016/j.intimp.2021.107773 |
| [12] | Tsujimura Y, Matsutani T, Matsuda A, et al. Effects of pioglitazone on survival and omental adipocyte function in mice with sepsis induced by cecal ligation and puncture[J]. J Surg Res, 2011, 171(2): e215-e221.. DOI:10.1016/j.jss.2011.08.012 |
| [13] | Kaplan J, Nowell M, Chima R, et al. Pioglitazone reduces inflammation through inhibition of NF-κB in polymicrobial sepsis[J]. Innate Immun, 2014, 20(5): 519-528. DOI:10.1177/1753425913501565 |
| [14] | Chung WY, Wanford JJ, Kumar R, et al. An ex vivo porcine spleen perfusion as a model of bacterial sepsis[J]. ALTEX, 2019, 36(1): 29-38. DOI:10.14573/altex.1805131 |
| [15] | Dkhil MA, Al-Quraishy S, Moneim AEA. Ziziphus spina-christi leaf extract pretreatment inhibits liver and spleen injury in a mouse model of sepsis via anti-oxidant and anti-inflammatory effects[J]. Inflammopharmacology, 2018, 26(3): 779-791. DOI:10.1007/s10787-017-0439-8 |
| [16] | Kingsley SMK, Bhat BV. Role of microRNAs in sepsis[J]. Inflamm Res, 2017, 66(7): 553-569. DOI:10.1007/s00011-017-1031-9 |
| [17] | Liang L, Fu JJ, Wang SR, et al. miR-142-3p enhances chemosensitivity of breast cancer cells and inhibits autophagy by targeting HMGB1[J]. Acta Pharm Sin B, 2020, 10(6): 1036-1046. DOI:10.1016/j.apsb.2019.11.009 |
| [18] | Wang XQ, Guo YQ, Wang CY, et al. microRNA-142-3p inhibits chondrocyte apoptosis and inflammation in osteoarthritis by targeting HMGB1[J]. Inflammation, 2016, 39(5): 1718-1728. DOI:10.1007/s10753-016-0406-3 |
| [19] | 孙江利, 冯辉, 牛泽群, 等. 吡格列酮抑制肺组织TLR2、TLR4的mRNA表达进而减轻重症急性胰腺炎肺损伤的机制探索[J]. 中华急诊医学杂志, 2021, 30(8): 960-965. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2021.08.008 |
| [20] | Hsieh MS, Hu SY, Liao SH, et al. Type 2 diabetic sepsis patients have a lower mortality rate in pioglitazone use: a nationwide 15-year propensity score matching observational study in Taiwan[J]. Emerg Med Int, 2021, 2021: 4916777. DOI:10.1155/2021/4916777 |
| [21] | Gao M, Jiang Y, Xiao XF, et al. Protective effect of pioglitazone on sepsis-induced intestinal injury in a rodent model[J]. J Surg Res, 2015, 195(2): 550-558. DOI:10.1016/j.jss.2015.02.007 |
| [22] | Haraguchi G, Kosuge H, Maejima Y, et al. Pioglitazone reduces systematic inflammation and improves mortality in apolipoprotein E knockout mice with sepsis[J]. Intensive Care Med, 2008, 34(7): 1304-1312. DOI:10.1007/s00134-008-1024-9 |