我国每年约有55万人发生心脏骤停（cardiac arrest, CA）事件，却仅有 < 1.0%的患者最终存活，已成为影响国民生命健康的重要问题^[1]。研究表明，CA患者在恢复自主循环后，大部分将继发复苏后脑损伤与心功能障碍，是患者死亡及存活质量下降的主要原因^[2-3]。然而，CA复苏所致的系统性缺血再灌注损伤，还会伤及心脑以外的其它多个重要器官，包括急性肾损伤、肠黏膜损伤等同样成为影响患者预后的重要因素^[4-5]。因而，加强复苏后急性肾损伤与肠黏膜损伤的关注与防治，对于改善CA患者的预后具有重要意义。

丁酸钠（sodium butyrate, NaB）是一种由肠道微生物发酵膳食纤维产生的短链脂肪酸，具有抑制Ⅰ类和Ⅱa类去乙酰化酶而影响目的基因表达的重要作用^[6-7]。近年来，在缺血再灌注损伤领域的研究表明，NaB具有减轻缺血再灌注后心、脑、肺、肾、肝、肠等多器官损伤的保护作用^[8-13]。但是，在心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation, CPR）领域，尚未见NaB对复苏后重要器官损伤的保护作用的研究。本研究拟利用猪CA-CPR模型探讨NaB对复苏后肾肠脏器损伤的影响及作用机制，以期为复苏后肾肠保护提供新的有效方法。

普通级国产健康大白猪24头，雄性，月龄4~6月，体质量33~40 kg，购自上海甲干生物科技有限公司，合格证号为SCXK（沪）2020-0006。该研究符合实验动物福利和伦理要求，获得浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会审批备案（批准号2022-026）。实验动物采用随机数字表法分为3组：假手术组（sham组，n=6）、CA-CPR组（n=10）与NaB组（n=8）。Sham组动物仅进行操作准备，CA-CPR组和NaB组通过心室颤动9 min与CPR 6 min的方法制备猪CA-CPR模型。于复苏后5 min时，NaB组经静脉泵入NaB（Sigma公司，美国）75 mg/kg、时长1 h，Sham组和CA-CPR组则经静脉泵入等量溶媒。

实验前夜动物禁食不禁水。实验时替来他明/唑拉西泮5 mg/kg（Virbac公司，法国）和噻拉嗪1 mg/kg（华牧公司，吉林）联合肌注诱导麻醉，再经耳缘静脉注射丙泊酚（力邦制药公司，西安）2 mg/kg全身麻醉，继以静脉泵入丙泊酚4 mg/（kg·h）维持麻醉状态。经口气管插管，分别连接呼气末二氧化碳分压监测仪（Sunlife公司，上海）和呼吸机（Air Liquide公司，法国），后者参数设置为潮气量10 mL/kg、吸呼比1∶2、氧浓度21%，以及调节呼吸频率维持初始的呼气末二氧化碳分压在35~40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。手术切开右侧股部皮肤，直视下剪开右侧股动、静脉，分别置入压力监测导管（Edwards公司，美国）至胸主动脉与右心房，用于监测大动物血压、心房压与核心体温，以及采集血标本。手术切开右侧颈部皮肤，直视下剪开右侧颈外静脉，置入室颤诱导电极，用于诱导心室颤动。应用体表心电电极、压力与温度传感器、脉氧探头等，连接心电监护仪（理邦公司，深圳），动态监测心率、血压、体温、脉氧饱和度等生命体征的变化。

首先，经室颤诱导电极释放1 mA交流电，诱发心室颤动，迅速确认后撤出电极，停止机械通气，无干预观察9 min。然后，开始CPR，即参照指南实施胸外按压和球囊辅助通气30∶2，同时应用PalmCPR装置（Sunlife公司，上海）监测CPR质量，以保障按压深度与频率分别维持在5~6 cm、100~120次/min。在CPR 2 min时，经静脉注射首剂肾上腺素20 μg/kg，此后每3 min重复使用1次。在CPR 6 min时，选择150 J双向波首次电除颤1次，迅速判断自主循环是否恢复。对于未恢复自主循环的动物，迅速开始CPR 2 min后再次电除颤1次，并重复该流程直至动物恢复自主循环或重复5次后宣布CPR失败。对于恢复自主循环者，重新机械通气，继续麻醉监护4 h，再送回猪圈观察20 h。

动态观察心率、血压、体温、脉氧饱和度等生命体征，记录动物复苏成功率与24 h存活率等造模情况。于造模前及复苏后1 h、2 h、4 h和24 h时，采集静脉血样，离心取上清冻存在−80℃深低温冰箱中，择期应用ELISA法检测肾肠损伤指标如肌酐（creatinine, Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、肠型脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein, IFABP）和二胺氧化酶（diamine oxidase, DAO）的血清水平，试剂盒购自上海美轩生物科技有限公司。

于复苏后24 h时，每组随机选择6头实验动物实施安乐死，迅速解剖获取左肾上极与回肠末端的组织标本，其中部分新鲜样本冻存于−80℃深低温冰箱，应用western blot法检测自噬标志蛋白的表达水平，即取组织样本，加入组织裂解液，10 000 g低温离心10 min，吸取上清测蛋白浓度，然后取等量样品进行SDS-PAGE蛋白电泳、PVDF转膜、5%脱脂牛奶室温封闭2 h，再加入LC3Ⅱ一抗（1∶1 000，Proteintech公司，美国）及p62一抗（1∶1 000，Proteintech公司，美国），置于4℃冰箱孵育过夜，取出后加入山羊抗兔二抗室温孵育1 h，最后在ECL下显影拍照，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH灰度比值反应目的蛋白表达水平。

另外，部分组织样本通过固定、包埋、切片等环节制作病理切片，然后应用TUNEL试剂盒（博士德生物公司，武汉）检测细胞凋亡程度，待样本处理完成后于200倍光镜下随机选择5个视野拍照，计算每张照片棕黄色阳性细胞占总细胞的比例，计算其平均值作为细胞凋亡指数。

使用SPSS 20.0统计软件（IBM公司，美国）进行数据统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ²检验法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

本研究共纳入24头实验猪。造模前，三组动物的血流动力学、脉氧饱和度、体温等生理指标及肾肠损伤标记物均在正常范围。造模后，CPR组与NaB组复苏成功率分别为90%（9/10）、87.5%（7/8），24 h存活率分别为70%（7/10）、87.5%（7/8），组间比较差异均无统计学意义（χ²=0.028、0.788，P > 0.05）。

CA-CPR组和NaB组在经历CA-CPR过程后，可见心率上升、平均动脉压下降，且心率在复苏后大部分时间点均明显快于Sham组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。NaB组心率在复苏2 h后均明显慢于CA-CPR组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。另外，NaB组平均动脉压在复苏1 h后高于CA-CPR组，组间比较差异无统计学意义（均P > 0.05）。见图 1。

与Sham组比较，aP < 0.05；与CA-CPR组比较，bP < 0.05 图 1 各组动物血流动力学参数的变化 Fig 1 The changes of hemodynamics in each group.

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CA-CPR组和NaB组在经历CA-CPR过程后，血清Cr与BUN水平升高，且在复苏后各时间点均明显高于Sham组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。NaB组Cr与BUN的血清水平上升较慢，在上述各时间点均明显低于CA-CPR组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.001）。见表 1。

CA-CPR组和NaB组在经历CA-CPR过程后，血清IFABP与DAO水平升高，且在复苏后各时间点均明显高于Sham组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。NaB组IFABP与DAO的血清水平上升较慢，在上述各时间点均明显低于CA-CPR组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.001）。见表 2。

CA-CPR组和NaB组复苏后肾肠组织的自噬水平高于Sham组，表现为LC3Ⅱ表达明显增加、p62表达显著减少，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。NaB组复苏后肾肠组织的自噬水平明显低于CA-CPR组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。见图 2。

与Sham组比较，aP < 0.05；与CA-CPR组比较，bP < 0.05 图 2 各组动物肾肠组织LC3Ⅱ与p62蛋白表达水平的变化 Fig 2 The changes of LC3Ⅱ and p62 expression in the renal and intestinal tissues in each group

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CA-CPR组和NaB组复苏后肾肠组织的细胞凋亡水平高于Sham组，表现为细胞凋亡指数明显增加，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。NaB组复苏后肾肠组织的细胞凋亡水平明显低于CA-CPR组，组间比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。见图 3。

与Sham组比较，aP < 0.05；与CA-CPR组比较，bP < 0.05 图 3 各组动物肾肠组织细胞凋亡指数的变化（TUNEL染色，×200） Fig 3 The changes of apoptosis indexes in the renal and intestinal tissues in each group (TUNEL staining, original magnification×200)

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NaB是一种具有多种生物学效应的短链脂肪酸，主要通过调控组蛋白乙酰化水平而影响细胞生命活动过程，已被证实具有抑制肿瘤细胞生长及促其凋亡、增强细胞抗缺血缺氧损伤的能力等^[8]。越来越多的研究表明，NaB在心、脑、肺、肾、肝、肠等多种器官缺血再灌注损伤的治疗过程中能产生器官保护效应。Cheng等^[9]建立大鼠急性心肌梗死模型，发现NaB能通过激活沉默调节蛋白3而影响活性氧产物、细胞自噬水平及血管新生能力，从而缩小心肌梗死面积及改善心功能状态。同年，Park等^[10]在老年雌性大鼠脑卒中模型中发现，NaB能通过抑制炎症反应与氧化应激、降低血脑屏障通透性、以及促进胰岛素样生长因子-1表达等途径，减少脑梗死容量和改善机体感觉运动障碍。Ying等^[11]建立小鼠肺缺血再灌注损伤模型，结果提示NaB能通过抑制核转录因子-κB和蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3信号通路激活，减轻受损肺组织炎性与氧化损伤的程度。Zheng等^[12]在大鼠肾缺血再灌注损伤模型中发现，NaB能减轻肾组织损伤及改善肾功能状态，考虑与抗炎抗凋亡效应有关。Sun等^[13]在大鼠肝缺血再灌注损伤模型中证实NaB能减轻肝组织损伤及改善肝功能状态，其保护机制为促进组蛋白H3乙酰化水平后增强热休克蛋白70介导的抗炎水平。Qiao等^[14]在大鼠肠缺血再灌注损伤模型中，发现NaB能减轻肠黏膜炎性细胞浸润及改善肠屏障功能，从而发挥肠保护作用。

CA复苏作为全身性缺血再灌注损伤的典型，NaB对其所导致的肾肠缺血再灌注损伤有无作用尚不清楚。结合上述研究的证据，本研究利用团队成熟的猪CA-CPR模型^[15]，试图探讨NaB对复苏后肾肠脏器损伤的效果。根据文献资料及动物剂量换算方法^{[10, 12, 14, 16-17]}，笔者选择在复苏成功后即刻经静脉注射NaB 75 mg/kg进行干预。结合文献报道^[18-19]，笔者选择Cr和BUN作为肾损伤标记物，IFABP和DAO作为肠黏膜损伤标志物。结果显示，与Sham组相比，经历CA-CPR过程的两组动物均出现复苏后肾肠损伤标志物的血清浓度显著升高，提示猪复苏后发生急性肾损伤和肠黏膜损伤。与CA-CPR组相比，所有接受NaB治疗的动物在复苏后各时间点的肾肠损伤标志物的血清水平显著下降，提示NaB能减轻猪复苏后急性肾损伤和肠黏膜损伤的程度，因而具有保护作用。此外，根据血流动力学监测结果，考虑NaB干预利于复苏后血流动力学恢复，进而产生较好的器官组织灌注，这可能是其复苏后肾肠器官保护作用的途径之一。

研究表明，自噬与凋亡是维护生物体内稳态的两种重要方式，其中前者的主要功能是选择性地降解受损细胞器和错误折叠蛋白，后者则重点清除受损或老化的细胞^[20]。但是，在缺血缺氧等应激状态下，自噬与凋亡只能适度地维持生物体内稳态，而当这种应激状态持续存在或过度强烈时，自噬会被过度激活，并加速细胞凋亡性死亡的发生^[21]。在局部或系统性缺血再灌注损伤研究中，自噬过度与凋亡加剧已被发现是缺血后肾肠器官损伤的重要因素，并成为器官保护措施的有效干预靶标。Ma等^[22]建立小鼠肾缺血再灌注损伤模型，发现miR-17-5p过表达能通过影响PTEN与BIM基因表达而启动Akt/Beclin1信号途径，进而减轻自噬与凋亡相关的肾组织损害。Li等^[23]建立大鼠肠缺血再灌注损伤模型，观察到缺血后肠组织细胞自噬与氧化应激损伤的现象，且应用自噬激活剂将加重这种损伤，而应用自噬抑制剂能通过抑制自噬与氧化应激而产生肠损伤减轻的保护作用。Liu等^[24]在大鼠失血性休克模型中，发现碳氧血红蛋白能通过抑制细胞自噬与凋亡、减轻氧化应激等途径而改善失血后肾功能状态。龚睿等^[25]在兔CPR模型中，发现外源性硫化氢能改善复苏后肠黏膜屏障功能障碍，其保护机制可能与抑制肠黏膜组织细胞自噬与凋亡、以及减轻其炎性与氧化损伤等有关。本研究结果显示，与Sham组相比，经历CA-CPR过程的两组动物复苏后肾肠组织LC3Ⅱ表达上调与p62表达下调、细胞凋亡指数升高，提示复苏后受损肾肠组织中发生细胞自噬过度与凋亡加剧的现象。而与CA-CPR组相比，经NaB治疗的动物肾肠组织中可见LC3Ⅱ表达下调与p62表达上调、细胞凋亡程度减轻，同时伴有肾肠损伤标志物的下降，提示NaB可通过抑制细胞自噬与凋亡而产生复苏后肾肠器官保护的作用。

本研究存在一些不足之处。首先，研究仅在单一时间使用单一剂量NaB，以致其最佳干预剂量及有效干预时间窗尚不清楚。其次，研究仅观察24 h内器官损伤情况及24 h组织病理状态，不能充分确认NaB对复苏后肾肠损伤的保护强度。再者，研究虽然发现NaB能减轻自噬、凋亡等程序性细胞死亡程度，但其分子调控机制仍有待阐明。

综上所述，在猪CA-CPR模型中，于复苏后即刻应用NaB进行治疗，能有效地减轻复苏后急性肾损伤和肠黏膜损伤的程度，其保护机制可能与抑制细胞自噬与凋亡有关。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  卢晓驰、徐杰丰：研究实施、文章撰写；卢晓驰、兰频、潘群婕、刘英、周光居和徐杰丰：研究实施、数据采集、整理和统计学分析；张茂：实验酝酿和设计、行政支持和指导