肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)又称流行性出血热，是由汉坦病毒导致、鼠类啮齿动物为主要传染源的自然疫源性传染病。HFRS分布呈世界性，在亚洲、欧洲、美洲、非洲等多个国家和地区均有流行，我国也是HFRS高发地区之一，每年病死率波动于0.60%~13.97%^[1]。

目前血清特异性抗体、汉坦病毒反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测是HFRS诊断的金标准，但部分患者的临床表现及检查结果缺乏特异度，容易漏诊、误诊，导致诊断困难，甚至延误治疗，尤其对于重症患者，漏诊、误诊后果更严重。近年来关于宏基因组测序用于临床微生物检测的研究逐渐增多，且在准确性和时效性方面显示出了一定的优势^[2-3]。然而，目前mNGS技术应用于HFRS的研究较缺乏，基于此，本文就血mNGS技术在HFRS重症患者中的诊断价值进行分析和探讨。

1 资料与方法 1.1 研究对象

本研究为回顾性观察性研究，以2020年1月至2022年6月郑州大学第一附属医院重症医学科收治的HFRS为研究对象。本研究经郑州大学第一附属医院科研和临床试验伦理委员会批准(伦理审批号：2022-KY-9043)。

纳入标准：(1)病案首页诊断为HFRS或流行性出血热；(2)符合《中华人民共和国卫生行业标准-流行性出血热诊断标准(WS278-2008)》^[4]确诊标准；(3)血液标本进行mNGS检测。

排除标准：(1)年龄小于14岁；(2)临床资料缺失；(3)未进行mNGS RNA检测。

HFRS确诊标准：①发热，可伴有乏力、恶心、呕吐、腹痛及腹泻等消化道症状；②充血、渗出和出血等毛细血管损害表现：如面、颈和胸部潮红(三红)，醉酒貌，头痛、腰痛和眼眶痛(三痛)，球结膜充血、水肿、皮肤出血点；③低血压休克；④肾脏损害：尿蛋白、镜下或肉眼血尿、少尿或多尿；⑤典型病程分为发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期、恢复期；⑥血常规：发热期外周血白细胞计数增高和血小板减少，出现异型淋巴细胞；血液浓缩或血液稀释；⑦尿常规：尿蛋白阳性，可有肉眼血尿，尿沉渣中可发现巨大的融合细胞；⑧血肌酐、尿素氮升高；⑨流行性出血热IgM抗体阳性。具备①②中至少一项加③④⑤⑥⑦⑧中至少一项加⑨即为确诊病例。

HFRS重症标准：体温40℃以上，有神经系统症状，休克，少尿5 d或无尿2 d以内。危重型诊断标准为在重症基础上出现以下情况之一：①难治性休克；②重要脏器出血；③无尿2 d以上；④其他严重合并症如心力衰竭、肺水肿、呼吸衰竭、昏迷、继发严重感染^[1]。

1.2 临床资料收集

收集并记录患者的临床资料，包括年龄、性别、人口学特征、流行病学特征、临床症状、体征、实验室检查、影像学检查及入重症监护室(intensive care unit, ICU)时的急性生理学及慢性健康状况评分系统(APACHE Ⅱ)评分等临床特征，诊断及预后情况。

1.3 抗体鉴定

所有患者均进行流行性出血热IgM、IgG抗体检测。

1.4 预后评价标准

肾功能正常标准：(1)尿量每日1 000~2 000 mL；(2)尿常规检查示尿蛋白阴性；(3)血肌酐检查示血肌酐值小于115 μmol/L。

1.5 宏基因组二代测序

取300 μL血浆进行DNA和RNA核酸提取；总RNA采用Illumina公司Ribo-Zero rRNA Removal Kit试剂盒进行rRNA去除，随后采用Thermo Fisher公司的逆转录酶和dNTPs将提取好的RNA逆转录成cDNA。采用基因组DNA片段化试剂盒对总DNA及逆转录后的cDNA进行建库，同时给待测核酸加上测序所需的标签序列；制备好的文库经过纯化、扩增、再纯化后，使用Qsep1和Qubit分别对文库片段大小和文库浓度进行定量。然后依据预设的上机数据量取定量文库混合后，使用Illumina公司的Nextseq 550Dx上机测序(单端75 bp测序，测序总序列数为20 M reads/样本)。

测序数据下机后去除低质量的和长度小于40 bps的数据以获得高质量的数据。通过BWA(BWA: http://bio-bwa.sourceforge.net/)将比对上GRCH38的序列去除；剩余的微生物序列与微生物数据库比对，并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列，并获得种水平特异性序列(SSRN)、属水平相对丰度、鉴定置信度等信息。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。使用Kolmogorov-Smirnova检验对计量资料进行正态性检验，非正态分布的连续性变量采用中位数(四分位数)[M(Q₁, Q₃)]表示，采用非参数检验中的Mann-Whitney U检验比较组间差异；分类变量用频数(n)描述，采用卡方检验比较差异。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 一般临床资料

最终纳入15例HFRS患者，均来自中国河南省，男性14例，女性1例，年龄14~62岁，中位数年龄33岁。10例患者明确有鼠类接触史。最常见的临床症状为发热(14/15)、乏力(13/15)、恶心呕吐(11/15)、头痛(10/15)、腹痛腹泻(6/15)，三痛征(同时具有头痛、腰痛、眼眶痛)(4/15)，三红征(同时具有面、颈、胸皮肤潮红)发生率为0%。见表 1。

2.2 影像学检查

所有患者均接受肾脏超声检查，2例双肾肿大，3例肾筋膜增厚，余患者无异常。

2.3 实验室检查

入院时患者体温39.1(38.6，39.6)℃、白细胞计数(WBC) 29.2(23.6，37.8)×10⁹/L、C反应蛋白61.7(43.6，79.9)mg/L、降钙素原9.6(4.2，27.9)ng/mL等高于正常范围；血小板计数17.0(14.0，32.0)×10⁹/L较低。见表 1。

3例患者入院时无尿，余12例患者入院尿常规尿蛋白均为阳性。

所有患者流行性出血热抗体IgM抗体均为阳性。

2.4 血mNGS结果

9例(9/15)患者血mNGS检出汉坦病毒。汉坦病毒阳性患者，mNGS检测距首发症状时间最长为12 d，最短为2 d，中位时间8 d；汉坦病毒阴性患者，mNGS检测距首发症状时间最长为9 d，最短为4 d，中位时间8 d；Mann-Whitney U检验差异分析结果显示，汉坦病毒阳性组与阴性组比较，送检mNGS时间距首发症状的时间差异无统计学意义(Z=-0.659，P=0.510)(见图 1)。

6例患者因mNGS结果提示汉坦病毒阳性，而进一步明确诊断为HFRS。

除汉坦病毒外，mNGS检出屎肠球菌、米尔伊丽莎白菌、痤疮丙酸杆菌、奥斯陆莫拉菌、约氏不动杆菌、藤黄微球菌、烟曲霉和肺炎支原体、巴氏梭菌，海氏肠球菌，咽颊炎链球菌，人类疱疹病毒、人类多瘤病毒。见表 2。

2.5 亚组分析

6例入院时因症状不典型未考虑HFRS，mNGS检出汉坦病毒后，进一步明确诊断的患者，其阳性敏感度为100%。其临床特征为：3例有不洁饮食史，症状为发热、腹痛、腹泻，无肌肉酸痛、腰痛、面部潮红、颈部潮红、皮肤潮红，初步诊断为肠道来源的细菌感染；1例症状为发热、呕血、便血，初步诊断为消化道来源细菌感染；1例症状为发热、腹痛、腹胀，胆囊区压痛，初步诊断为胆囊炎；1例症状为发热、咳嗽、咳大量黄痰，初步诊断为肺部来源细菌感染。

预后情况：5例存活，1例出院3 d后死亡，死亡原因为家属放弃治疗。实验室检查结果见表 3。

2.6 预后

15例患者均完成电话随访，随访中位时间为1年。3例死亡(均为出院后96 h内)，11例肾功能正常，1例肌酐升高。

3 讨论

mNGS基于第二代测序技术，具有不受传统培养条件限制、筛选病原广泛、出结果时间快等优势，已越来越多的应用于临床感染性疾病的诊治^[5]，mNGS检测多种细菌、真菌、病毒等病原微生物的研究均有相关报道^[6-7]，而目前临床上使用mNGS技术检测汉坦病毒仅有少量个案报道^[8]。本研究收集、分析、总结了15例行mNGS检测的HFRS患者的临床资料，结果显示，9/15的HFRS患者通过mNGS筛选出了汉坦病毒，其中6/15的患者血mNGS检测筛查出汉坦病毒后，经血清流行性出血热IgM抗体检测明确诊断。

传统可用于确诊HFRS的检测方法包括：血清特异性IgM抗体、IgG抗体滴度、标本中分离到汉坦病毒或标本中检出汉坦病毒RNA^[4]。mNGS无需预设、不依赖于培养，可直接检测临床样本中的病原微生物(包括细菌、真菌、病毒、寄生虫、及非典型病原体)，可涵盖新发、少见、及常规检测方法无法检出的病原体^[9]。HFRS的临床表现多样，出现典型临床表现者少^[10]，大部分患者缺乏典型的“三红征”、“三痛征”，本研究中6例患者入院时未考虑到HFRS，由mNGS检出汉坦病毒后诊断HFRS。此6例患者无典型的“三红征”、“三痛征”，5例以消化道症状为主，1例以呼吸道症状为主，此6例患者反应细菌感染的指标如白细胞，CRP，PCT均较高，易误诊为消化道或呼吸道来源的细菌感染导致的脓毒症。故对于不典型的HFRS患者，mNGS具有较好提示作用。由于HFRS危重型病死率明显高于其他类型，漏诊导致的治疗延误可能产生严重后果，早期明确诊断可给予更有针对性的治疗，改善患者预后。

邱建明等^[11]研究表明逆转录-套式PCR对HFRS患者发病7 d内血清RNA的检测率为100%，但本研究患者发病7 d内mNGS检出阳性率66.7%，12 d阳性率为60%。结果显示，汉坦病毒阳性组与阴性组比较，送检mNGS时间距首发症状的时间差异无统计学意义，提示本研究汉坦病毒mNGS结果阴性，非送检时间的差异导致。本研究mNGS对于汉坦病毒检测敏感度相对较低考虑可能为两方面原因：①汉坦病毒为RNA病毒，而RNA不稳定，容易分解，若留取标本至检测时间较长易导致检测结果阴性；②样本中RNA本身含量较低，低于mNGS检测下限。故对需检测RNA病毒样本，采样及样本运输、检测时，应注意使用添加核酸稳定剂的试管，同时冷链运输，并及时进行检测^[12]。mNGS技术本身尚有较大的优化和发展空间，一直有新的技术手段更新换代，较新的宏基因测序技术^[13]可能有助于提高RNA病毒的检出率。因此，当mNGS检测结果与患者临床症状不符时，需根据临床资料进行进一步检查，以明确诊断，避免漏诊。

本研究患者病死率为20%，与本研究所有患者均为HFRS重型或危重型有关。有文献报道危重型HFRS病死率高达74%^[14]。此外研究样本量小，存在一定的偏倚。文献报道^[1]，HFRS男女比例为3∶1, 本研究男女比例为14∶1，与既往研究趋势相同，均为男性患者多于女性患者，另外本研究样本量小，存在一定偏倚。本研究为mNGS对于HFRS诊断价值的研究，尚无性别是否可影响mNGS检测结果的研究，故男女比例对于本研究结果的影响尚无法确定。本研究对于不典型临床表现HFRS患者，mNGS阳性检出率为100%，与本研究收集病例方法有关。mNGS和HFRS抗体检测目前均非ICU的常规检查，在实际临床工作中仍然可能有一部分HFRS患者因未施行这项检查而漏诊，因此mNGS在临床工作中有很大的应用空间。

mNGS检出汉坦病毒的同时，可同时检测是否合并其他病原菌感染，本研究中7例患者检出汉坦病毒外的病原菌，但需结合患者临床症状及其他辅助检查，综合判断所测出病原菌是否为致病菌^[9]。同时严格遵守标本采集指南对于减少标本采集时导致的污染至关重要。

本研究具有一定的局限性：(1)研究为单中心回顾性研究，仅统计行mNGS检测的HFRS患者汉坦病毒检出阳性率，未能统计mNGS检出汉坦病毒的特异度及误诊率；(2)研究样本量较小，需要未来大样本量研究，以增加结论的可靠性；(3)本研究患者均为重型及危重型HFRS，是否适用于其他分型尚需进一步研究。

综上所述，在临床诊疗中，对于不典型HFRS患者，mNGS可作为传统检测手段的有效补充，提高HFRS明确诊断率，在一定程度上减少漏诊与误诊事件。为不典型HFRS患者，特别是重症患者的进一步诊疗，赢取更多的时间和机会，从而改善疾病结局和预后。此外，由于现有mNGS检测方法仍在进步中，一致性存在差异，因而对于临床拟诊HFRS而mNGS结果为阴性的患者，仍建议完善抗体及病毒分离等检测进一步筛查以明确诊断。

利益冲突   所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明   王海旭、赵颖颖：实施研究、分析/解释数据、论文撰写；闫浩、付明森、王彩云、赵阳超、贠文晶、时学秀：统计分析、数据收集及整理、技术支持；孙同文：研究设计、论文修改、获取研究经费