2023, Vol. 32
2. 广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所，广州 510623
2. Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou 510623 China
脓毒症（sepsis）是机体对感染反应失控而引起的致死性器官功能障碍，是医院最常见的危急重症之一[1-2]。急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是sepsis最常见的并发症，有研究表明，在住院患者中，约50%~ 67%的脓毒症患者会出现AKI，且病情凶险，进展迅速，预后差，病死率高[3]，其发生机制可能与炎症反应，肾小管坏死和微循环功能障碍等有关。乌司他丁是一种从尿液中提取的广谱蛋白酶抑制剂，具有较强的抗炎和细胞保护作用，临床上常用于治疗急慢性胰腺炎、循环衰竭等[4]。最近有研究表明，乌司他丁在sepsis方面，具有较好的治疗效果[5]，但其在SA-AKI中的作用仍待进一步研究。本研究拟采用盲肠结扎穿刺法（cecal ligation and puncture，CLP）建立sepsis小鼠模型，从体内外两方面评价乌司他丁对SA-AKI的保护作用，并探讨其相关机制，为今后SA-AKI的诊治提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 动物SPF级C57BL/6（8~12周龄）雄性小鼠60只，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2019-0010。本实验动物处理方式经中山大学实验动物伦理委员会审查批准（批件号：SYSU-IACUC-2021-B1131）。实验期间小鼠饲养在清洁通风的环境中，温度20~26℃，湿度50%~60%，明暗循环各12 h，自由进食。
1.2 主要试剂乌司他丁购自广东天普生化；EdU细胞增殖试剂盒购自广州锐博；CCK8细胞活力试剂盒购自美国APExBIO；JC-1线粒体膜电位试剂盒购自北京索莱宝；MEM培养基、胎牛血清购自武汉普诺赛。青霉素-链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、LPS购自美国Sigma；F4/80组化抗体购自武汉赛维尔。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和p-NF-κB抗体购自美国CST。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附检测（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉菲恩。
1.3 脓毒症肾损伤模型将60只雄性C57BL/6小鼠随机（随机数字法）分为假手术组（Sham组），脓毒症模型组（CLP组）和乌司他丁处理组（CLP+ UTI组），每组15只。采用CLP术构建脓毒症小鼠模型。用0.75%戊巴比妥钠20 mL/kg腹腔注射麻醉，碘伏消毒后铺无菌洞巾，沿腹部正中线切开腹腔，找到盲肠，用5号线在回盲部远端1/3处结扎盲肠，用16号无菌针垂直穿透盲肠，并挤出少许肠内容物，随后将盲肠还纳回腹腔，逐层缝合。术后皮下注射50 mL/kg 0.9%生理盐水进行液体复苏。CLP组+乌司他丁组CLP术后给予50 000 U/kg乌司他丁腹腔注射，1次/d；Sham组及CLP组术后给予同等体积0.9%生理盐水腹腔注射，1次/d。各组随机选取5只小鼠在术后24 h采用过量麻醉后颈椎脱臼处死，取肾脏组织进行下一步实验；剩余小鼠用于观察7 d生存情况。
1.4 HE染色手术后24 h将小鼠过量麻醉后颈椎脱臼处死后，4%多聚甲醛灌注并固定，常规进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片，置于显微镜下观察肾组织病理改变。
1.5 免疫组织化学固定后的小鼠肾脏进行透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡至水、抗原修复、封闭、孵育F4/80组化一抗过夜、孵育二抗、DAB显色、苏木精复染细胞核、封片，最后置于显微镜下观察拍照。
1.6 细胞培养及分组人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）购自武汉普诺赛，使用含10%FBS，1%双抗的MEM培养基，在条件为37℃、5%的CO2的培养箱中培养HK-2细胞。待细胞密度生长至80%时，将细胞分为3组：对照组（Control组）、LPS组（LPS 1 000 ng/mL）和LPS+乌司他丁组（LPS 1 000 ng/mL，乌司他丁400 U/mL），放入培养箱继续培养24 h后进行下一步实验。
1.7 CCK8实验检测细胞活力接种在96孔板的HK-2细胞在含或不含乌司他丁（400 U/mL）的培养基中，加入LPS刺激24 h后，根据说明书要求，按照10：1比例用无血清培养基配置CCK8反应液，每孔加入110 μL的CCK-8反应液，放入37℃，5% CO2培养箱孵育3 h后用酶标仪在450 nm波长处读取各孔内的OD值。
1.8 EdU实验检测细胞增殖能力接种HK-2细胞至48孔板，按照分组将细胞处理后，用培养基稀释EdU A液至终浓度为50 μmol/L，孵育3 h后，用4%多聚甲醛固定细胞并使用0.5%曲拉通渗透剂通透细胞，配置Apollo染色液并进行避光孵育30 min，然后对各组细胞核进行DAPI染色，最后在荧光显微镜下进行观察拍照。
1.9 线粒体膜电位检测按照50 μL JC-1 (200×)加入8 mL的超纯水比例稀释JC-1工作液，剧烈震荡充分摇匀，然后再加入2 mL JC-1染色工作液（5×），充分混匀后即为JC-1工作液。将处理好的各组细胞用PBS洗涤后，加入配置好的JC-1工作液在培养箱中孵育20 min；在冰上配置好1× JC-1工作液备用；孵育结束后，去除上清液，并用1× JC-1工作液洗涤2次后，向各组细胞中加入适量培养基，最后在荧光显微镜下进行观察拍照，并使用Image J软件（1.5i）进行统计分析。
1.10 Western blot将各组细胞用PBS清洗后，冰上裂解，经超声，离心后收集上清液液；对蛋白进行定量后，将其与上样缓冲液按照4：1的比例混合，煮沸使其变性，后经电泳、转印、封闭、孵育抗体等过程后，用伯乐ECL发光液在化学成像系统中进行曝光，结果用ImageJ软件（1.5i）进行灰度分析。
1.11 炎性因子检测TNF-α和IL-6使用ELISA法按照说明书要求进行检测。
1.12 统计方法采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，每组实验都至少重复3次以上，所有数据均用均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用Bonferroni法，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 乌司他丁提高脓毒症小鼠的生存率各组小鼠均饲养至7 d，Sham组小鼠术后7 d内无死亡，7 d生存率100%；而CLP组小鼠在第7天累计死亡12只，中位生存时间仅为3 d，7 d生存率为20%；而CLP+UTI组在第7天累计死亡10只，中位生存时间为4 d，7 d生存率为33%，生存率明显增加（图 1A），且与CLP组相比生存率具差异有统计学意义（P＜0.5）。
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| A: 各组小鼠7 d生存曲线；B: 各组小鼠肾组织病理情况改变（HE）；C: 各组小鼠肾组织炎性细胞浸润情况（免疫组织化学）；Sham组为假手术组；CLP为盲肠穿刺结扎组；CLP+UTI为盲肠穿刺结扎+乌司他丁组；与Sham组比较，P＜0.05；与CLP组相比，P＜0.05;标尺：200 μm 图 1 乌司他丁对脓毒肾小鼠7 d生存率与肾组织病理改变及炎性细胞浸润的影响 Fig 1 Effects of Ulinastatin on 7-day survival rate, renal histopathological changes and inflammatory cell infiltration in septic kidney mice |
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Sham组肾脏组织结构正常，肾小管上皮细胞规则排列；CLP组小鼠肾组织切片可见肾小管明显扩张，空泡变性，肾小管上皮细胞大量变性、坏死，刷状缘脱落，间质内大量F4/80（巨噬细胞标志物）浸润。与CLP组相比，CLP+UTI组小鼠肾组织切片损伤程度明显减轻（图 1B），间质内仅有少量巨噬细胞浸润（图 1C）。
2.3 乌司他丁对LPS诱导后HK-2细胞活力的影响采用CCK8法检测LPS及乌司他丁对HK-2细胞活力的影响，与对照组相比，LPS处理24 h后，HK-2的细胞活力呈浓度依赖性下降，其中以1 000 ng/mL的浓度下降最为明显（图 2A），因此选取1 000 ng/mL的LPS进行后续实验。值得注意的是，乌司他丁能以浓度依赖性性的方式减轻LPS对HK-2细胞活力的抑制作用（图 2B），且在浓度为400 U/mL时效果最好。
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| A：CCK8检测LPS对HK-2细胞活力的影响；B: CCK8检测乌司他丁对LPS诱导的HK-2细胞活力的影响；注：LPS为脂多糖；UTI为乌司他丁；与对照组比较，aP＜0.05；与LPS组相比，bP＜0.05； 图 2 乌司他丁对LPS诱导后HK-2细胞活力的影响 Fig 2 Effects of ustatin on the viability of HK-2 cells induced by LPS |
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利用EdU实验检测细胞的增殖能力，结果显示，Control组、LPS组、LPS+UTI组细胞的增值率分为35.6%、21.4%、26.7%；与Control组相比，LPS处理后明显抑制了HK-2细胞的增殖，而LPS+UTI组的EdU阳性率高于LPS组，说明了细胞增殖能力的恢复（图 3A）。
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| A: EdU检测HK-2增殖情况；B: EdU阳性率；JC-1检测HK-2线粒体膜电位；注：Control为对照组；LPS为脂多糖处理组；LPS+UTI为脂多糖+乌司他丁处理组；与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组相比，bP＜0.05；标尺：400 μm 图 3 乌司他丁对LPS诱导后HK-2增殖和线粒体膜电位的影响 Fig 3 Effects of ustatin on HK-2 proliferation and mitochondrial membrane potential induced by LPS |
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利用JC-1试剂盒检测肾小管上皮细胞线粒体膜电位变化，结果显示，与对照组相比，LPS刺激后，绿色荧光的JC-1单体明显增加，红色荧光的JC-1聚合体减少，说明LPS可明显损伤HK-2细胞的线粒体膜电位；而加用乌司他丁处理后，绿色荧光的JC-1单体减少，红色荧光的JC-1聚合体增加，提示乌司他丁可减轻LPS对HK-2线粒体膜电位的损伤（图 3B）。
通过western blot检测细胞中NF-κB磷酸化的水平，结果显示，与对照组相比，LPS刺激后，HK-2细胞NF-κB磷酸化水平增加；LPS+UTI组NF-κB磷酸化水平降低（图 4A，B）。
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| A: western blot检测p-NF-κB的表达；B: 蛋白表达统计结果；C和D：ELISA检测各组细胞上清液中IL-6和TNF-α的浓度注：Control为对照组；LPS为脂多糖处理组；LPS+UTI为脂多糖+乌司他丁处理组；与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组相比，bP＜0.05 图 4 乌司他丁对LPS诱导后HK-2细胞NF-κB磷酸化和炎性因子分泌的影响 Fig 4 Effects of Ulinastatin on NF-κB phosphorylation and inflammatory factor secretion in HK-2 cells induced by LPS |
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采用ELISA法检测细胞上清液中炎性因子的水平，结果显示，与对照组相比，LPS促进了HK-2细胞上清液中IL-6和TNF-α的分泌，而乌司他丁处理后，减少了HK-2细胞上清液中IL-6和TNF-α的含量（图 4C，D）。
3 讨论Sepsis是机体对感染反应失调的以多器官功能障碍为主要特征的临床综合征。AKI是sepsis最常见的并发症，与无AKI的sepsis患者相比，SA-AKI患者起病急，病情重，病程长，病死率高，被认为是sepsis患者死亡地带独立危险因素[6-7]。乌司他丁是一种从人类尿液中分离纯化的光谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，在多种细胞和动物模型中有很强的抗炎和细胞保护作用，临床上被广泛用于治疗急性循环衰竭、胰腺炎等疾病[4]。更重要的是，有文献报道，乌司他丁在治疗脓毒症方面也有很好的效果。一项纳入263名脓毒症危重患者的回顾性研究发现，乌司他丁能显著降低患者28 d病死率[8]。2021年，亢宁苏等[9]研究发现乌司他丁可能通过下调心房钠尿肽（atrialnatriureticpeptide，ANP）、肾损伤分子1(kidney injury molecule 1，KIM-1）、白介素-18、胱抑素C及中性粒细胞相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）表达，抑制sepsis早期过度炎症反应，对SA-AKI起到一定的肾脏保护作用，但其具体的作用机制尚不清楚。Chao等[10]研究表明，乌司他丁可以提高CLP诱导sepsis小鼠的生存率并减弱小鼠的炎症反应。本研究发现CLP诱导的sepsis小鼠7 d生存率仅为20%，乌司他丁治疗后，小鼠的生存率有所改善（7 d生存率33%），与文献报道一致，同时我们发现CLP组小鼠肾组织切片可见肾小管明显扩张，空泡变性，肾小管上皮细胞大量变性、坏死，刷状缘脱落，间质内大量巨噬细胞浸润，而乌司他丁治疗后可明显改善sepsis小鼠肾脏组织的病理改变，提示乌司他丁对SA-AKI有一定治疗作用，但其是通过何种途径发挥对SA-AKI的保护作用，目前尚未明确。
肾皮质近曲小管上皮细胞损伤是AKI的主要发病机制之一，研究表明，在sepsis发生时，由于大量炎性介质的释放，直接或间接损伤肾小管上皮细胞，导致其线粒体受损，引起能量代谢障碍，诱导肾小管上皮细胞凋亡，促进SA-AKI的发生、发展[11]。因此本研究采用LPS处理HK-2细胞建立SA-AKI细胞模型进行体外研究，结果表明，当LPS（250 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL）处理HK-2细胞24 h后，细胞活力呈浓度依赖性下降，与Lu等[12]研究结果一致。同时笔者发现，在乌司他丁处理后，HK-2细胞活力有所上升，说明乌司他丁可以减轻LPS对HK-2细胞的损伤。本研究还发现，在LPS的作用下，明显抑制了HK-2细胞的增殖，而乌司他丁恢复了HK-2细胞的增殖能力，这些结果进一步证实了乌司他丁对肾小管的保护作用。线粒体损伤是引起sepsis的关键因素之一，正常的线粒体对维持肾脏内环境的稳态至关重要[13-16]。Sepsis发生时，由于线粒体损伤，导致肾脏内ATP耗竭和活性氧增多，进而引起细胞内稳态失衡以及器官功能障碍[17]。本研究中发现，在LPS刺激后，HK-2细胞中绿色荧光的JC-1单体明显增加，红色荧光的JC-1聚合体减少，而在乌司他丁处理后，上述现象明显有所改善，说明乌司他丁可明显减轻LPS对HK-2细胞线粒体的损伤。作为细胞内重要的转录因子，NF-κB在炎症、氧化应激、凋亡等过程中起着至关重要的作用[18-19]。研究发现，NF-κB是sepsis发病机制中的关键分子，当sepsis发生时，细菌感染引发的炎症反应会导致线粒体损伤，使活性氧（reactive oxygen，ROS）的产生增多，而ROS会引起细胞内的氧化应激从而激活NF-κB信号通路，导致NF-κB的磷酸化和活化。活化的NF-κB会进一步促进炎症反应基因的转录和炎症介质的产生，如TNF-α、IL-6等，从而加速了病情的发展[20]。在sepsis动物模型中，抑制NF-κB的活化可减少细胞内炎性因子的分泌，减轻肾损伤，因此控制NF-κB的活化可能有助于调节炎症反应和改善脓毒症的治疗效果。而在本研究中，乌司他丁可明显抑制LPS诱导的HK-2细胞NF-κB的磷酸化水平，同时减少了细胞上清液中TNF-α和IL-6的分泌。这说明乌司他丁发挥对保护肾脏的作用可能与其抑制NF-κB活化和抗炎作用有关。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 张春敏：研究设计、论文撰写；杨文敏：数据收集及整理；林永敏、胡培丹：实验操作；苏妹玲：统计学分析；陈飞燕：分析、解释数据、论文修改
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