2024, Vol. 33
2. 新疆医科大学附属肿瘤医院日间病房二病区，乌鲁木齐 830011;
3. 新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科，乌鲁木齐 830011;
4. 惠州市第六人民医院消化内科，惠州 516200
2. Ward 2, Day Ward, Affiliated Cancer Hospital, Xinjiang Medical University, Wulumuqi 830011, China;
3. Department of Respiratory Neurology, Cancer Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Wulumuqi 830011, China;
4. Department of Gastroenterology, the Sixth People's Hospital of Huizhou, Huizhou 516200, China
肺栓塞(pulmonary embolism，PE) 是静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism, VTE)中最严重的临床症状[1-2]。据估计，该病的年发病率约为(65~70)/10万居民，近几十年有所增长[3]，病死率高达2.1/10万，占住院病死率的0.5%~20%，30 d内病死率为5%~30%[4]，是造成全球非传染性疾病负担的因素之一。但PE是一种由多方面因素引起的疾病，具有广泛的组织学和分子变异，其特异性分子基础尚不清楚。有研究表明，DNA甲基化可通过参与血栓调控基因的表达在血栓形成过程中发挥作用，来调节血栓的形成[5]。此外，在DNA甲基化机制的调节下[6]，可以改变一些编码止血蛋白基因的表达[7]，从而改变止血蛋白在不同条件下的血浆浓度，如FⅦ、FⅧ和组织型纤溶酶原激活剂等均已被证实。因此，本研究通过高通量测序及DNA甲基化芯片检测，联合分析PE患者及健康对照者，基因甲基化与基因表达谱之间的关系，拟寻找参与PE疾病发生发展的调控基因及相关可能生物信号通路。
1 资料与方法 1.1 研究对象收集2019年1月至2019年12月单纯PE和健康对照者外周静脉血5 mL各4例, 两组基线资料，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。两组观察对象均已签署相关知情同意书，并通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审核，伦理审批文书批号为2019BC007。
| 组别 | 样本量（人） | 年龄（岁，x±s） | 男/女（例） | P值 |
| PE组 | 4 | 55.16±2.25 | 2/2 | 0.230 |
| 健康对照组 | 4 | 54.32±3.12 | 2/2 |
PE组纳入标准根据《中华医学会呼吸病学分会肺血栓栓塞症的诊断与治疗指南》[8]符合以下任意一项即可确诊：（1）CTPA提示肺动脉内的低密度充盈缺损，部分或完全包围在不透光的血流之间轨道征，或者呈完全充盈缺损，远端血管不显影；（2）V/Q扫描高度可能性：2个或2个以上肺段灌注缺损，通气正常，通气-灌注不匹配；（3）选择性肺动脉造影提示肺血管内造影剂充盈缺损，伴或不伴轨道征的血流阻断。健康对照组纳入标准：既往无恶性肿瘤、心脑血管、血液、内分泌、肝肾疾病，且无慢性阻塞性肺疾病、哮喘等相关病史且与PE组性别、年龄相当的相同地区健康者。排除标准为患有除PE以外其他系统疾病（或合并PE）患者。
1.3 检测与实验方法 1.3.1 DNA提取及甲基化芯片的检测取量程2.5微升洗脱后的DNA溶液，读取A260及A280值，选取吸光度（OD）值(A260 nm/280 nm)为1.7~1.9，得到基因组DNA，经过亚硫酸盐转化、NaoH变性、PCR扩增、利用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（850 K芯片）杂交、高通量测序技术检测基因甲基化水平。
1.3.2 RNA提取及测序抽取实验对象外周静脉血5 mL，使用TRIzol试剂（日本TaKaRa公司）提取基因组RNA，利用bcl2fastq等软件对基因组位置进行筛选、分类及分析。差异表达基因确定条件为|log2FC| ≥1且P＜0.05(FC为差异表达倍数，即实验组与对照组差异表达倍数在2倍以上且P＜0.05。选择两组间共同差异表达的上调和下调的lncRNA，以显著性P值和差异表达倍数作为判断标准进行差异性分析。差异表达lncRNA的GO及KEGG信号通路富集分析。
1.4 数据学方法利用R包Limma分析甲基化位点并检验差异位点的显著性。采用SPSS 25.0及Graphpad prism 8.0等软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用独立样本的t检验，显著差异CpG位点默认筛选标准为：P＜0.05。差异性分析利用limma、DESeq包以筛选条件为|log2FC|≥1且P ≤0.05。根据基因/转录本的表达量计算，样品间的Pearson相关系数范围是|r|≤1。
1.5 联合分析筛选有差异的甲基化基因和表达基因，绘制散点图、circos图，以及差异表达基因各个区段的甲基化分布图，分析DNA甲基化和基因表达数据共表达状态，寻找出基因上游TSS区域差异甲基化且与表达负相关的基因，再绘制DNA甲基化和基因表达相关性热图，进行转录因子-靶基因预测、转录因子-基因表达调控网络以及GO和Pathway富集分析。
2 结果 2.1 PE组对比健康对照组的转录上游区域差异甲基化的表达差异根据基因表达数据进行差异表达基因分析，同时对差异甲基化基因进行筛选，再将DNA甲基化和基因表达数据进行共表达分析，基因上游区域差异甲基化与基因表达呈负相关，其中共筛选出基因上游区域TSS1500显著甲基化基因有6个，分别为TSPO2、C1QA、AQP1、TNFSF9、MIA、STAB 1，基因表达差异倍数分别是1.298，1.629，1.024，2.746，2.539，1.060。两组间甲基化差异分别是-0.049，-0.053，-0.048，-0.057，-0.050，-0.053。而基因表达与基因甲基化之间的相关度分别是-0.908，-0.900，-0.824，-0.784，-0.783，-0.779。TSS200区域显著甲基化基因有3个，分别为TSPO2，SLCPB，SIGLEC1，基因表达差异倍数分别是1.298，-2.252，1.866，基因表达与基因甲基化之间的相关度分别是-0.860，-0.774，-0.739，两组间甲基化差异分别是-0.051，0.027，-0.048（P＜0.05），见表 2。
| 基因名称 | 基因表达 | 基因表达Log2FC | DNA甲基化 | 甲基化∆β值 | 甲基化位点区域 | r值 | P值 | ||
| PE组 | 健康对照组 | PE组 | 健康对照组 | ||||||
| TSPO2 | 1.378±0.153 | 0.723±0.323 | 1.298 | 0.638±0.013 | 0.686±0.021 | -0.049 | TSS1500 | -0.908 | 0.002 |
| C1QA | 2.055±0.600 | 0.755±0.177 | 1.629 | 0.611±0.027 | 0.664±0.023 | -0.053 | TSS1500 | -0.900 | 0.002 |
| TSPO2 | 1.378±0.153 | 0.723±0.323 | 1.298 | 0.753±0.015 | 0.804±0.016 | -0.051 | TSS200 | -0.860 | 0.006 |
| AQP1 | 1.331±0.392 | 0.778±0.278 | 1.024 | 0.545±0.034 | 0.593±0.019 | -0.048 | TSS1500 | -0.824 | 0.012 |
| C1QB | 0.682±0.347 | 0.177±0.152 | 2.953 | 0.630±0.033 | 0.695±0.032 | -0.065 | 5UTR | -0.801 | 0.017 |
| TNFSF9 | 0.621±0.523 | 0.122±0.089 | 2.746 | 0.475±0.021 | 0.533±0.013 | -0.057 | TSS1500 | -0.784 | 0.021 |
| MIA | 0.716±0.232 | 0.299±0.199 | 2.539 | 0.745±0.017 | 0.795±0.007 | -0.050 | TSS1500 | -0.783 | 0.022 |
| TSPO2 | 1.378±0.153 | 0.723±0.323 | 1.298 | 0.814±0.016 | 0.859±0.011 | -0.045 | 5UTR | -0.779 | 0.023 |
| TSPO2 | 1.378±0.153 | 0.723±0.323 | 1.298 | 0.814±0.016 | 0.859±0.011 | -0.045 | 1stExon | -0.779 | 0.023 |
| STAB 1 | 7.014±0.658 | 4.538±2.694 | 1.060 | 0.387±0.021 | 0.440±0.026 | -0.053 | TSS1500 | -0.779 | 0.023 |
| SLC9A3 | 0.541±0.528 | 1.236±0.279 | -2.252 | 0.079±0.016 | 0.051±0.012 | 0.027 | TSS200 | -0.774 | 0.024 |
| MS4A4A | 1.203±0.758 | 0.258±0.084 | 2.137 | 0.623±0.041 | 0.703±0.030 | -0.080 | 5UTR | -0.770 | 0.025 |
| AQP1 | 1.331±0.392 | 0.778±0.278 | 1.024 | 0.419±0.008 | 0.439±0.006 | -0.020 | 5UTR | -0.750 | 0.032 |
| SIGLEC1 | 3.185±2.576 | 0.777±0.584 | 1.866 | 0.742±0.022 | 0.789±0.016 | -0.048 | TSS200 | -0.739 | 0.036 |
| 注：FC：差异表达倍数；∆β值：两对比组甲基化水平差值；TSS1500：转录起始点上游1500 bp内区域；TSS200：转录起始点区域上游200 bp内；5UTR：5'非翻译区；1stExon：第一个外显子区域；r值：pearson相关系数 | |||||||||
从热图可以看出在这些基因中，在PE组中有TSPO2、C1QA、AQP1、TNFSF9、MIA、STAB 1、SIGLEC1共7个基因呈现低甲基化高表达状态。只有SLC9A3基因在PE患者中呈现高甲基化低表达，而在健康对照组中为低甲基化高表达。
2.3 利用KOBAS注释系统，进行PE患者TSS区域差异甲基化且差异表达基因的GO、KEGG富集分析 2.3.1 PE患者TSS区域差异甲基化且差异表达基因的GO功能在细胞组分方面（黄色）包括补体C1复合物；刷状缘膜；共生体-含液泡；含共生液泡膜；胶原蛋白；刷状缘；宿主细胞细胞质。在生物过程方面（蓝色）包括补体活化，经典途径；循环免疫球蛋白介导的体液免疫反应；补体活化；寄主对含共生液泡的维持；跨上皮水运输；激活蛋白级联；肌动蛋白细胞骨架的极性；二氧化碳跨膜运输；调控细胞毒T细胞分化；正向调控细胞毒T细胞分化；免疫球蛋白介导的免疫反应；B细胞介导免疫反应；细胞毒性T细胞分化；细胞对汞离子的反应；二氧化碳运输；脑脊液分泌；唾液分泌的正向调节；一氧化氮运输；唾液分泌调节；肾水转运。在分子功能方面（红色）包括一氧化氮跨膜转运蛋白活性；二氧化碳跨膜转运蛋白活性，见图 2。
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| 红色表示上调差异表达或高甲基化，蓝色表示下调差异表达或去甲基化 图 1 TSS区域差异甲基化-基因差异表达热图 Fig 1 Heat map of differential methylation in TSS region and differential gene expression |
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| 横坐标为富集到该通路的基因数目，纵坐标为不同基因富集到不同生物组学功能 图 2 DNA甲基化差异-基因差异表达GO功能分析条形图 Fig 2 DNA methylation difference-gene differentially expressed GO functional analysis bar chart |
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在有机系统中包括有免疫系统、排泄系统、内分泌系统及消化系统。在人类疾病中包括退行性神经疾病、寄生虫病、细菌感染及免疫疾病。在信息处理中包括信号分子和相互作用，见图 3。
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| 横坐标为富集到该通路的基因数目，纵坐标为不同基因富集到不同生物组学方面的生物通路。 图 3 DNA甲基化差异-基因差异表达KEGG生物通路富集分析条形图 Fig 3 Differential DNA methylation-Differential gene expression KEGG biopathway enrichment analysis bar chart |
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本研究发现，TSPO2、C1QA、AQP1、TNFSF9、MIA、STAB 1、SLC9A3、SIGLEC1等基因在PE的发生过程中起作用。TSPO2在PE患者体内相对于健康对照组中，呈现低甲基化高表达状态，而有研究表明胆固醇结合蛋白TSPO2诱导胆固醇在内质网中积聚[9]，从而可以通过改变成红细胞中的细胞内胆固醇分布来调节胆固醇的可用性，并协调终末分化成红细胞的成熟和增殖[10]。而导致PE的Virchow三要素（血管内皮细胞损伤、血流状态的改变、血液凝固性升高）致使血栓形成，应该根据是否存在影响内皮损伤、血流停滞和高凝状态的问题来评估患者是否存在增加静脉血栓栓塞风险的因素[11-12]。根据笔者实验结果，胆固醇结合蛋白TSPO2低甲基化高表达，可能通过诱导胆固醇积聚促使血液高凝状态的发生，从而改变血流状态，从而参与PE的发生。高凝状态可以是先天基因（如蛋白C、S缺乏和同型半胱氨酸水平升高）[13]或后天获得（如炎症、癌症、激素）[14]。而严重肥胖[体重指数（BMI）＞35] 患者发生VTE的风险比BMI正常(＜25) 高6倍。补体C1q是由C1QA、C1QB、C1QC基因分别编码补体C1q一个亚单位的A、B、C 3条多肽链。C1q是免疫防御的第一线分子，通过促进止血积极参与原发性止血。有研究结果表明C1q在炎症性疾病并发血栓栓塞症时出现过量沉积[15]。这项发现与笔者所证实的C1QA在PE患者中呈现低甲基化高表达结果相符。除此之外，在Pini等[16]研究发现AQP1的表达增加，同时伴有HIF-1α和HIF-2α的表达增加，AQP1表达与细胞的缺氧特征相关。因此本实验，AQP1的低甲基化高表达可能因为参与细胞缺氧，从而致使PE发生和发展。肿瘤坏死因子配体超家族成员9（TNFSF9）[17]及MIA[18]具有一系列与调节炎症反应相关的生物学功能，因此不除外TNFSF9和MIA所参与的炎症反应进而引起PE可能。以及SIGLEC1可通过miR-1260依赖性降解COPD中的IκBα来增强炎症[19]，抑制SIGLEC1表达则可以抑制单核细胞中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和M-CSF）的表达[20]。故可通过多种基因、生物通路、各分子机制来来了解PE的根本因素。
而通过高通量测序筛选PE及正常人差异DNA甲基化基因及共表达差异基因，证实靠近转录起始位点甲基化与基因表达呈负相关。笔者对两组间DNA甲基化差异表达靶基因在GO和KEGG生物通路富集分析，帮助我们进一步了解PE甲基化差异调控基因表达，在生物学功能和通路上发挥作用。结合本实验结果在GO功能分析中，在补体活化、免疫反应、激活蛋白级联等都得到显著富集。在KEGG信号通路中，免疫系统、细菌感染以及信号分子及相互作用方面得到显著富集，后续可以通过上述生物组学及信号通路方面再做更加深入的研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 曹嘉芮：负责数据收集、论文设计与撰写；李伟、曹国磊：参与数据收集及分析；罗琴：参与选题与设计、论文指导和修正；何丽丽、牛海文、李晓晗：参与数据分析
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