2024, Vol. 33
脓毒症的最新定义为宿主感染所导致的免疫反应失调引起的危及生命的器官功能障碍[1]，其发生、发展过程与其自身免疫功能的紊乱密切相关，有不同的CD4+T细胞参与其中。其中有CD4+T淋巴细胞分泌大量的白介素22(Interleukin，IL)-22，因此得名辅助型T淋巴细胞亚群22(简称Th22细胞)[2-3]。作为一种新型的CD4+T细胞亚群，Th22细胞具有强烈的促炎作用。有研究表明，脓毒症患者外周血Th22细胞和IL-22水平明显提高[4]，作为一种促炎因子，IL-22可诱导大量促炎细胞因子和趋化因子的表达，促进炎性细胞向感染部位募集，放大机体炎性反应，对脓毒症患者早期诊断及病情严重程度的评估具有重要的临床价值。同时，IL-22在多种炎症性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤的发生、发展过程中扮演着重要的角色[5-7]。
当病原体侵入机体，最先产生免疫应答反应的就是固有免疫(非特异度免疫)，从而保护机体免受侵袭[8]。核苷酸结合寡聚化结构域样蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain like receotor protein 3，NLRP3)炎症小体为机体免疫系统的一个重要组成部分，与脓毒症发生、发展的关系最密切[9]，是目前研究最为广泛的炎症小体类型[10]。多种物质触发NLRP3炎症小体寡聚化和激活，核心蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-like protein containing a caspase ectuitment domain，ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶前体(cysteine aspartate specific protease-1 precursor，pro-caspase-1)在胞质内组装成为NLRP3炎症小体，形成具有催化活性的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate specific protease-1，caspase-1)，后者再将IL-1β和IL-18的前体剪切成熟并分泌至效应部位参与炎症反应的发生、发展过程。有研究表明，IL-22通过活化NLRP3炎症小体刺激皮肤角质细胞分泌IL-1β来增强皮肤炎症[11]，值得一提的是，在IL-22能否活化NLRP3炎性小体介导脓毒症的发生发展尚无报道。为探讨IL-22对NLRP3炎性体表达的影响，本课题通过体外培养巨噬细胞，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导巨噬细胞活化，检测NLRP3炎症小体活化通路相关分子的表达，旨在研究IL-22对LPS诱导巨噬细胞中NLRP3炎症小体NLRP3、caspase-1表达及IL-18、IL-1β分泌的影响，为研究IL-22在脓毒症的治疗中提供新思路。
1 材料与方法 1.1 实验材料巨噬细胞RAW264.7，购自武汉赛维尔公司细胞库；DMEM高糖培养基购自BI公司；胎牛血清购自上海yeasen；Real-time PCR所用引物购于上海生工公司；总RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒购自于上海yeasen；脂多糖购于Sigma公司；重组小鼠IL-22购于上海近岸生物；小鼠IL-18、IL-1β ELISA试剂盒购于上海凡科维公司；兔抗NLRP3购于北京BIOSS；兔抗Caspase-1购于北京BIOSS；兔抗β-actin购于北京BIOSS；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购于biosharp。
1.2 实验方法培养巨噬细胞RAW264.7，将培养的细胞分为3组(空白对照组、LPS组、LPS+IL-22组)，并对各组实验细胞进行干预，分别培养3、6、24 h，收集各组细胞及上清液，检测巨噬细胞NLRP3炎症小体活化时NLRP3、caspase-1的表达及IL-18、IL-1β的分泌水平。
1.2.1 培养巨噬细胞将培养瓶从37℃、5% CO2培养箱中取出，肉眼观察培养基颜色后，在光学显微镜下观察细胞生长形态，在细胞生长状态良好的情况下，将培养瓶喷洒酒精后放入已灭菌的超净台，弃去培养瓶中培养基，加入5 mL的PBS充分清洗细胞培养瓶底部2~3次，最后向培养瓶中加入5 mL培养基，此后1~2 d进行换液并观察细胞生长状态，待生长到占瓶底80%~90%时进行细胞传代，取生长状态比较好的第3~4代细胞用于实验。
1.2.2 CCK8试剂盒检测不同浓度的LPS、IL-22对细胞活性的影响取生长至满足条件要求的巨噬细胞(聚合度80%)，胰蛋白酶消化并离心后，重置细胞悬液并取适量用细胞计数仪计数，剩余细胞悬液稀释至合适的密度，按照分组情况接种到无菌96孔板中，每孔加入100 μL(约105个细胞)，培养24 h后，按不同浓度LPS(0、1、5、10、50、100 μg/mL)、不同浓度IL-22(10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL)进行刺激，每孔加入100 μL，每组设5个复孔，做好相应标记。37℃，5%CO2恒温培养箱中培养24 h后，每孔分别加入10 μL的CCK-8液，培养箱温育2 h后，用酶标仪检测450 nm时OD值。根据细胞活力值=[(实验组一空白组)/(对照组一空白组)]×100%，计算各组细胞活力值。
1.2.3 实验分组RAW264.7细胞增殖状态处于对数期时，消化并种接种于6孔板内，每个板内细胞数约1×105/mL，每个孔内含1 mL完全培养基。培养至细胞生长密度约80%后，加入药物进行处理(对照组除外)，分组情况如下。
① 对照组：加入常规完全培养基后，未添加任何试剂，培养至细胞贴壁于瓶底约80%后，提取细胞及上清液；②LPS组：加入LPS(10 μg/mL)至细胞中干预3、6、24 h后提取细胞及上清液；③LPS+IL-22组：加入LPS(10 μg/mL)+IL-22(100 ng/mL)至细胞中干预3、6、24 h后提取细胞及上清液。
1.2.4 酶联免疫分析(ELISA)检测共培养细胞上清中IL-18、IL-1β的分泌水平小鼠IL-18、IL-1β酶联免疫分析试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠IL-18、IL-1β水平，所有的实验步骤均按照ELISA说明书进行，使用酶标仪读取450 nm波长处的吸光度值(OD值)，根据标准曲线计算血清中IL-18和IL-1β的含量。
1.2.5 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA的表达根据分组情况，于不同时间点收集共培养细胞，按照RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，利用紫外分光光度计测定核酸溶液后，发现D260/D280均在1.9~2.1范围内，说明其纯度较好可用于后续试验。进行逆转录后以cDNA为模板，采SYBR Green I染料法，以NLRP3、caspase-1、GADPH基因特异度引物进行PCR扩增。反应条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环。分析基因扩增的平均Ct值，以GAPDH为内参(189 bp)，按照公式2-ΔΔct进行相对定量计算。各种基因引物序列及扩增产物大小见表 1。
| 引物名称 | 引物序列 | 扩增产物大小(bp) | |
| GAPDH | Forward | 5’-TTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTA-3’ | 189 |
| Reverse | 5’-AGGCAGATGGCCACAGGACTA-3’ | ||
| Reverse | 5’-CCTATCAGCAGTGGGCATCTGTA-3’ | ||
| NLRP3 | Forward | 5’-ACTGAAGCACCTGCTCTGCAAC -3’ | 88 |
| Reverse | 5’- AACCAATGCGAGATCCTGACAAC -3’ | ||
| caspase-1 | Forward | 5’-TGCCTGGTCTTGTGACTTGGA-3’ | 94 |
| Reverse | 5’-CCTATCAGCAGTGGGCATCTGTA-3’ | ||
提取细胞总蛋白，取生长情况良好的巨噬细胞(细胞生长密度约80%~90%)，加入预先配制的1 mL裂解液(RIPA∶PMSF =100∶1), 充分裂解后，将裂解完全装有混合液的EP管置于高速低温离心机内，12 000 rpm离心15 min，收集上清液，即为总蛋白溶液。采用二喹啉甲(Bbicinchonininc acid, BCA)法进行蛋白浓度的测定。配制分离胶、浓缩胶，经蛋白上样、十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，转膜，转移至5%脱脂牛奶(封闭液)中，室温下置于摇床1 h。β-actin(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)特异度一抗孵育于4℃摇床过夜。次日孵育HRP标记的二抗(1∶1 000)室温下孵育2 h。使用超敏化学发光检测试剂盒显色，用凝胶图像分析系统采集图片，PhotoShop整理去色，Image J软件处理系统分析目的蛋白和内参蛋白的灰度值，通过计算实验组与对照组间目的蛋白/内参蛋白灰度值的升高或降低程度来表示实验组的目的蛋白表达水平的变化情况。
1.3 统计学方法实验数据使用Graphpad Prism 9.0统计分析软件进行作图以及统计学差异分析，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，双侧P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 巨噬细胞形态实验需要培养大量的巨噬细胞RAW264.7，并且使用细胞状态最好的对数期细胞进行造模干预，将培养好的细胞置于倒置显微镜下观察其形态，正常的巨噬细胞形态基本大体规则，大多呈圆或椭圆形，小部分为多角形梭型等不规则的形态，细胞的折光性比较良好，胞质很饱满，部分细胞伸出伪足，此时便可用于进行接下来的实验。
2.2 不同浓度LPS对巨噬细胞活力的影响通过CCK-8试剂盒检测LPS对巨噬细胞活力的影响，结果表明LPS药物浓度在1~100 μg时，巨噬细胞活力值会有变化，其中LPS对巨噬细胞的IC50为16.38 μg，参考值范围在3.26~114.30 μg之间，因此本实验选择LPS的作用浓度为10 μg，处于安全药物浓度范围内。见图 1。
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| 图 1 不同浓度LPS对巨噬细胞活力的影响 Fig 1 Effects of LPS at different concentrations on macrophage activity |
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通过CCK-8试剂盒检测IL-22对巨噬细胞活力的影响，结果表明IL-22药物浓度在10~1 000 ng时，巨噬细胞活力值会有变化，其中IL-22对巨噬细胞的IC50为61.51 ng，参考值范围在24.03~141.1 ng之间，因此本实验选择IL-22的作用浓度为100 ng，处于安全药物浓度范围内。见图 2。
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| 图 2 不同浓度IL-22对巨噬细胞活力的影响 Fig 2 Effect of IL-22 at different concentrations on macrophage activity |
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IL-18、IL-1β在炎症性疾病中至关重要，ELISA检测对照组与LPS组上清液中IL-18、IL-1β的含量，结果如图 3所示。与对照组相比，LPS干预后细胞IL-18分泌水平增加，24 h达高峰(P < 0.01)，IL-1β分泌水平增加，6 h达高峰(P < 0.05)。为探索IL-22在LPS诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化中的调控作用，在上述实验基础上使用LPS、IL-22联合刺激巨噬细胞，结果显示，LPS+IL-22组IL-18的分泌水平与LPS组相比，明显升高(P < 0.05)、IL-1β的分泌水平与LPS组相比差异无统计学意义。见图 3。
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| a为P < 0.05，b为P < 0.01，a为P < 0.001 图 3 各组细胞培养上清液IL-18、IL-1β的分泌水平 Fig 3 The secretion levels of IL-18 and IL-1β in cell culture of each group |
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NLRP3、caspase-1 mRNA的扩增曲线(图 4)均显示，各组样品的扩增曲线平滑，拐点清楚，基线平行且无上扬，各曲线整体平行性良好，说明各反应管中NLRP3、caspase-1 mRNA的扩增效率相近。NLRP3、caspase-1 mRNA的溶解曲线(图 5)，各组样品均有较强的荧光增强信号，表现为阳性扩增，各溶解产物曲线均只有单一峰，表明反应过程中没有产生任何非标靶产物。
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| A：NLRP3 mRNA扩增曲线；B：caspase-1 mRNA扩增曲线C：GAPPH mRNA扩增曲线 图 4 NLRP3、caspase-1、GAPPH mRNA的扩增曲线 Fig 4 Amplification curves of NLRP3, caspase-1 and GAPDH mRNA |
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| A：NLRP3 mRNA溶解曲线；B：caspase-1 mRNA溶解曲线C：GAPPH mRNA溶解曲线 图 5 NLRP3、caspase-1、GAPDH mRNA的溶解曲线 Fig 5 Dissolution curves of NLRP3, caspase-1 and GAPDH mRNA |
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为探索IL-22在LPS诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化中的调控作用，使用LPS、IL-22联合刺激巨噬细胞进行研究，结果显示，LPS+IL-22组NLRP3、caspase-1 mRNA的相对表达量较LPS组增高(P < 0.05)，并于6 h达到高峰，结果见图 6。上述RT-PCR与ELISA研究结果显示，LPS与IL-22共同作用于巨噬细胞后NLRP3炎症小体活化相关的NLRP3、caspase-1 mRNA的表达和IL-18、IL-1β的分泌水平明显升高。
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| a为P < 0.05，b为P < 0.01，a为P < 0.001 图 6 各组细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达量 Fig 6 Relative expression levels of NLRP3 and caspase-1 mRNA in cells of each group |
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对照组及LPS组细胞中115 000的NLRP3蛋白条带、41 000的caspase-1以及42 000的β-actin的蛋白条带见图 7；LPS+IL-22组细胞中NLRP3蛋白条带、caspase-1以及β-actin的蛋白条带见图 8。
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| 图 7 NLRP3、caspase-1蛋白在对照组、LPS组细胞中的表达 Fig 7 Expression of NLRP3 and caspase-1 proteins in the control group and LPS group |
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| 图 8 NLRP3、caspase-1蛋白在LPS+IL-22组细胞中的表达 Fig 8 Expression of NLRP3 and caspase-1 proteins in cells of the LPS+IL-22 group |
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经ImageJ图像分析软件分析，以β-actin标化后，LPS组NLRP3、caspase-1蛋白表达均明显高于对照组(P < 0.05)。LPS+IL-22组NLRP3蛋白表达显著高于LPS组(P < 0.001)，LPS+IL-22组caspase-1蛋白表达显著高于LPS组(P < 0.01)，结果见图 9。
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| A为各组NLRP3/β-actin的比值，B为各组caspase-1/β-actin的比值，即相对蛋白表达量；a为P < 0.05，b为P < 0.01，a为P < 0.001 图 9 标化后各组NLRP3、caspase-1蛋白表达对比 Fig 9 Comparison of NLRP3 and caspase-1 protein expression in each group after standardization |
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机体内过度的炎症反应是导致脓毒症和多器官功能紊乱的核心病理事件，研究炎症反应的关键环节并进行拮抗是脓毒症研究重要方向，NLRP3炎症小体作为机体免疫系统的重要组成部分，在机体炎症发生中发挥关键调节作用。NLRP3炎症小体的组成主要包括核心蛋白NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白pro-caspase-1[12]。其中，核心蛋白NLRP3是模式识别胞内受体Nod样受体蛋白家族的成员，广泛表达于中性粒细胞、树突细胞、单核巨噬细胞，具有识别病原体的功能[13]。接头蛋白ASC是NLRP3炎性体的双重衔接蛋白，能够以某种桥梁的形式将NLRP3和pro-caspase-1连接起来，最终形成具有酶活性的异二聚体caspase-1[14]。效应蛋白pro-caspase-1通过自身酶解作用形成具有生物活性的caspase-1，后者再将IL-1β和IL-18的前体剪切成熟并分泌，IL-1β和IL-18是强有力的炎症启动因子，在脓毒症的发生、发展过程中起着重要作用，可作为病情严重程度的重要指标[15]。尽管NLRP3炎症小体的正常激活有助于宿主防御，但过度激活会导致由促炎性细胞因子IL-1β、IL-18介导的炎症性疾病，包括脓毒症、阿尔茨海默病、与低温蛋白相关的周期性综合征、糖尿病和多种自身炎症性疾病等[16-18]。有研究发现，小鼠盲肠结扎穿孔模型中(cecal ligation and puncture, CLP)，小鼠的肾脏和脾脏中IL-22水平是升高的[19]，而CLP建模后抑制IL-22的表达则能增强细菌清除率，促进吞噬细胞募集，减轻器官功能障碍。针对16例腹部术后脓毒症患者的研究表明，健康志愿者和非脓毒症手术对照组相比，脓毒症患者的血清IL-22水平也显著升高[20]，这证明了IL-22在脓毒症进程中具有一定的作用。Th22细胞可特征性分泌IL-22，其在调节炎性疾病相关的炎性反应中具有重要作用，IL-22是一种促炎性调节因子，发挥上调炎症反应，促进炎性介质产生的作用，在脓毒症的发展中发挥重要作用。巨噬细胞来源于外周血中的单核细胞，具有吞噬降解细菌、释放炎症介质、介导炎性细胞趋化、抗原提呈等活性，在抗感染、抗肿瘤免疫中发挥着非常重要的作用[21]。巨噬细胞广泛分布于体内，是机体NLRP3炎症小体和其下游分子IL-1β、IL-18的重要来源，因此巨噬细胞成为脓毒症相关研究中最常用的细胞[22]。本试验中通过培养巨噬细胞，用IL-22和(或)LPS处理3、6、24 h后，检测巨噬细胞中NLRP3、caspase-1的表达变化及IL-18、IL-1β分泌，结果表明，LPS作用于巨噬细胞后，在3h至24 h内，NLRP3、caspase-1的表达水平升高，IL-1β、IL-18分泌水平均有不同程度的增加，相比对照组差异均有统计学意义(P < 0.05)。为探索IL-22在LPS诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化中的调控作用，LPS与IL-22共同刺激巨噬细胞后，在3 h至24 h内，NLRP3、caspase-1的表达水平，IL-18分泌水平均有不同程度的增加，相比LPS组差异有统计学意义(P < 0.05)，IL-1β的升高程度与LPS组相比差异无统计学意义。
综上所述，IL-22能显著增加LPS诱导巨噬细胞NLRP3、caspase-1的表达及细胞因子IL-18、IL-1β的分泌，促进NLRP3炎症小体的活化。这提示IL-22可能通过某些信号通路促进LPS诱导巨噬细胞中NLRP3、caspase-1的表达及细胞因子IL-18、IL-1β的分泌，在脓毒症固有免疫应答中发挥一定的作用。但是，IL-22是如何调控LPS诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化，仍需进一步探索。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 韩雪妹：研究设计、研究实施、统计学分析、论文撰写；王日兴：研究设计、论文修改
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