临床上多种多样类型的感染会引起严重的临床症状，影响患者的预后，往往对临床医生尤其是在重症监护医生构成极大的挑战。原发性非感染性疾病危重患者往往由各种严重的细菌、真菌、病毒感染或因免疫抑制或侵入性感染引起。因此，快速检测病原体和有效的抗感染治疗对于改善危重患者的预后以及减少住院时间，减少公共卫生资源消耗有重要指导意义^[1-2]。

宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing technology，mNGS）技术是一种新的微生物检测技术，通过高通量测序可以直接从感染样本中的提取所有微生物中核酸信息，进而获得有关可疑病原体（细菌、真菌、病毒、寄生虫和其他病原体）的信息。此外，mNGS可以检测出血培养无法检测到的细菌、微量细菌和病毒，且无需培养，有望改善临床样本中病原体的检出率^{[3, 4]}。然而，因为mNGS技术仍然属于相对较新的技术，许多临床医生没有将这种技术在疾病的早期以及进展阶段中作为首选，往往是在传统诊断方法失败治疗后才使用，因此mNGS技术的合理应用存在争议^[5]。因此，本研究回顾性分析了213例接受治疗的危重患者的临床资料，并应用mNGS诊断技术，进而分析mNGS的临床价值和适用性。

1 资料与方法 1.1 研究对象

收集2021年11月至2022年5月因重症感染入住商丘市第一人民医院213例患者的临床数据，收集样本包括脑脊液、血液、组织、痰液、肺泡灌洗液、胸水等，本研究经本院医学伦理委员会批准进行（批号：2021-015），所有患者或其监护人均对本研究知情同意。所有患者分别进行支气管肺泡灌洗液以及脑脊液、血液、组织、痰液、胸水的mNGS检测和传统培养技术（血液培养、脑脊液培养、胸水培养、肺泡灌洗液培养和痰培养）。重症患者纳入标准包括：（1）重症感染的诊断符合《抗菌药物临床应用知道原则（2015）》中的重症感染诊断标准，同时符合医院获得性感染诊断标准。患有感染或疑似感染；（2）临床上确诊为重症患者，包括脓毒症，重症肺炎，重症脑炎等。排除标准包括：（1）不满足重症的诊断标准；（2）未同时进行mNGS检测和传统培养技术；（3）病例资料不完整；（4）样本污染无法进行检测。

1.2 临床样本收集

临床数据由两名经验丰富的主治医师专家独立收集。按照标准的临床程序采集样本。分别获取各科室送检的脑脊液、血液、组织、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液以及石蜡切片和引流液。基线数据收集自患者的电子医疗记录，包括人口统计特征、既往病史、实验室检查、影像学、病理学、诊断和治疗等。

1.3 传统微生物学检查技术

使用传统培养技术分析所有患者的临床标本，依照试剂说明书，包括血培养，细菌培养，自动化的微生物识别系统或菌种进行培养分离鉴定以及血清免疫学检查（血液及CSF隐球菌荚膜多糖抗原检测、EB病毒抗体检测、巨细胞病毒抗体检测、单纯疱疹病毒抗体检测、肺炎支原体抗体检测、布鲁氏杆菌抗体检测、流行性乙型脑炎病毒抗体检测）和病原体核酸检测[（脑脊液和血液EB病毒，脑脊液单纯疱疹病毒和巨细胞病毒及结核分枝杆菌核酸检测，肺泡灌洗液肺炎支原体核酸检测），]基于聚合酶链反应（PCR）的检测技术等。

1.4 mNGS检测技术

mNGS血液样本或肺泡灌洗液样本至少需要采集5 mL，脑脊液样本至少需要采集3 mL。血液样本采集时应使用抗凝试管而且保存环境为室温，抗凝管中的保护剂为乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂和特殊脱氧核糖核酸（DNA）保护剂。而其他所有的样本再接受mNGS检测前都需要保存在液氮中。里面含有EDTA抗凝剂的试管中的血液标本保存在室温下持续3~5 min，在8 h以内4℃下以4 000 r/min的转速共离心10 min，经过离心分离后的血浆样本转移至新的无菌试管中。对于符合腰椎穿刺或支气管镜检查适应证的患者经临床医生标准操作后收集BALF或CSF样本。采集样本后，向1.5 mL离心管添加0.5 mL样品和1g 0.5 mm玻璃珠，放置在涡旋器水平平台上，在2 800~3 200 r/min的转速下搅拌30 min，搅拌后将0.3 mL样本分离至新的1.5 mL离心管，使用组织均质器将组织均质化。根据标准无菌处理程序，核酸使用TIANamp Micro DNA试剂盒（DP316，天根生物科技，中国北京）。样本分装、提取、纯化等处理。通过DNA断裂片段化、末端修复、测序接头连接以及PCR扩增提取DNA制备DNA文库，测序在BGISEQ-500平台上进行。减去人类宿主序列后读取非人类序列人工智能化分析，去除低质量的序列，获得高质量的序列数据，与病原微生物基因组数据库（http://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/）进行了比较，数据库包括与人类疾病有关11 910种细菌，7 103种病毒、1 046种真菌和305种寄生虫。对映射数据进行处理和分析，并对可疑数据进行分析，列出了病原体，包括读取次数、覆盖率、以及严格映射的深度，生成检测报告。

1.5 统计学方法

所有资料经双人核对后录入EXCEL，采用SPSS 24.0统计软件处理数据。若计量数据符合正态分布，则采用均数±标准差（x±s）表示；若计量数据不符合正态分布，则采用中位数（四分位数）[M(Q₁, Q₃)]表示描述。组间比较用t检验，计数资料采用χ²检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 临床样本一般基线特征分析

收集的样本和患者的一般特征本研究共收集213危重病例，其中男146例，女67例，年龄为39.00（8.50, 60.00）岁。送样科室包括神经内科43例，呼吸科44例，（其中呼吸重症监护室11例，呼吸介入科30例，呼吸与危重病科1例，呼吸科2例），儿科60例（其中新生儿加强监护室13例、儿科25例、儿科重症监护室22例），重症医学科41例，急诊科21例（其中急诊内科3例、急诊重症监护室18例），感染科3例，病理科1例。送检样本包括脑脊液、血液、组织、痰液、肺泡灌洗液，胸腔积液，见表 1。

2.2 mNGS检测技术与传统病原学检测各类样本病原体诊断性能的比较

与传统病原学检测技术比较，各类型样本mNGS病原体检测的阳性率明显增高(69.48% vs. 27.23%，P < 0.05)；其中脑脊液、血液、组织、痰液、肺泡灌洗液，胸水mNGS病原体检测的阳性率和传统检测技术阳性率分别是(37.50% vs. 22.22%，78.95% vs. 50.00%，76.92% vs. 30.77%，92.86% vs. 21.43%，62.50% vs. 12.50%，均P < 0.05)（见表 2）。

对213例重症性疾病患者结合病原学检测和临床分析结果进行两种方法的诊断效能统计。传统病原学和mNGS检测的敏感度分别为41.18%、89.87%，两者敏感度差异具有统计学意义（P < 0.05）。传统病原学和mNGS检测的特异度分别为97.7%、89.9%，两者的特异度差异无统计学意义（P > 0.05）。传统方法与mNGS检测的阳性预测值（PPV）分别为96.55%、95.95%，阴性预测值（NPV）分别为45.16%、24.62%。见表 3、表 4。

2.3 mNGS检测技术与传统病原学检测病原体种类分析

传统病原学检测技术检出菌种数22种，而mNGS病原体检测菌种数65种。Mngs检出病原体种类依次为细菌、真菌、病毒和非典型病原体，其中细菌主要以流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和鲍曼不动杆菌；真菌以白色念珠菌为主；病毒以细环病毒和人类疱疹病毒为主；而非典型病原体以肺炎支原体为主（见附图1）。

2.4 两种方法检测病原体类型的比较

两种方法检测病原体类型中，可以发现mNGS可以检测到病毒类型，传统方法未检测到病毒。见表 5。

2.5 mNGS检测技术与传统病原学检测混合感染病原体比较

213例各类重症患者的临床样本中，mNGS检测技术检出单一病原体感染16例，传统检测方法检出为29例，高于mNGS检测技术（P=0.040）。mNGS检测病原体技术检出混合感染132例，传统检测方法检出为29例，高于传统检测方法（P < 0.001）。最常见细菌和细菌混合感染，其次细菌和真菌、细菌和病毒或病毒和病毒混合感染，细菌、真菌和病毒混合感染较少，见表 6。

2.6 mNGS检测技术与传统病原学检测病原体检测时间比较

mNGS病原体检测时间为（1.56±0.69）d，传统检测技术检测时间为（4.11±0.61）d，差异有统计学意义（P < 0.05），mNGS检测技术用时明显减少。

3 讨论

合理使用抗生素对免疫耐受和（或）危重患者的治疗至关重要，病原学诊断是必要关键环节。传统的微生物检测技术包括血液培养、血清免疫学检查和基于聚合酶链反应（PCR）的检测技术等。血液培养周期长，往往需要3~7 d，而且检测来自临床标本的血液培养阳性率呈下降趋势^[6-8]。血清免疫学检查和PCR技术只能检测几种特定病原体，并且需要专用试剂盒和引物。一些患有复杂疾病的危重患者中感染部位往往难以识别，在这种情况下将很难获得合格的样本^[9]。因此，获得临床样本感染病原体信息是针对性治疗危重感染患者的有效手段。

随着分子生物学的发展，基于mNGS技术的价值逐渐被认识，尤其是用于检测罕见、非典型或生长缓慢的微生物^[10]。mNGS可用于临床多种无菌样本的分析，包括脑脊液、血液和关节积液等^[11]。但mNGS检测对于非无菌体液包括痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、组织等也有一定应用^[12]。近年来mNGS的研究发展已经能够鉴定和检测呼吸道病原学感染^[13]。本研究中，主要分析了213例危重感染患者临床样本，送样科室包括多个重症感染常见科室，送检样本包括脑脊液、血液、组织、痰液、肺泡灌洗液，胸水等多种临床检测样本。经过比较分析，与传统病原学检测技术比较，各类型样本mNGS病原体检测的阳性率明显增高，提示mNGS在诊断病原体中敏感度和特异度较高。而且mNGS在对脑脊液、血液、组织、痰液、肺泡灌洗液，胸水等样本的病原体检测的阳性率显著高于传统检测技术阳性率，以上结果提示mNGS病原体检测技术在检测各类临床样本中均有广泛的敏感度，应用价值高。

本研究通过对不同临床样本的检测发现传统病原学检测技术检出菌种数22种，而mNGS病原体检测菌种数65种。mNGS检测技术与流行病学和临床特征相结合，确定识别病原微生物。重症住院患者往往因疑似感染的病因未明确诊断持续存在，导致治疗延迟或不充分，住院时间延长，甚至再次入院，病死率和发病率增加^[14]。感染的病原体包括许多常见和不常见的病原体，而且由于早期服用广谱或预防性抗菌药物，导致病原体在常规培养（即培养基中的生长）受到限制，生长缓慢^[15]。传统检测技术可能漏掉罕见病原体或使用引物与所涉及的微生物菌株不匹配，降低了检测敏感度^[16]。而与其他诊断技术相比，mNGS主要优点之一是无偏见采样，能够广泛识别已知和未知病原体甚至新生物的发现。mNGS也可以耦合到目标，使用保守16S核糖体RNA的引物和通用细菌和真菌的内部转录间隔序列检测，可以对这些生物体进行物种级鉴定^[17]。

进一步分析发现，213例各类重症患者的临床样本中，mNGS检测技术检出单一病原体感染16例，传统检测方法检出为29例，显著高于mNGS检测技术。mNGS检测病原体技术检出混合感染132例，传统检测方法检出为29例，显著高于传统检测方法，因此体现了mNGS检测在鉴定混合感染的优势。mNGS检测有利于临床对重症患者的针对性治疗，避免滥用抗生素问题，进而为提供患者疗效和改善预后提供帮助^[18]。自2004年问世以来，高通量或二代测序的成本逐年下降，而且检测耗时少^[19-20]。本研究存在一定局限性，部分样本样本量较少，且为单中心回顾性研究，没有对患者治疗以及预后进行随访。在进一步的研究中，需要进行多中心大样本前瞻性研究，并设计随访，进而完善数据，为mNGS技术在重症患者抗感染治疗中检测指导意义提供更多依据。

本研究证实mNGS病原体检测病原体敏感度高，检测种类全，耗时短，能够鉴别混合感染，可用于检测各类临床样本，有利于指导重症患者的抗感染治疗，具有重要临床意义。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  徐秀丹：数据整理，统计学分析，文章撰写；焦鹏：数据库建立，数据采集；翟盈盈：研究设计，技术指导，论文修改

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