1 TMEM16A通道结构功能

2008年，TMEM16A被确定为是钙离子激活氯离子通道蛋白家族成员，同时证明该通道可以被胞内钙浓度增加激活^[1-3]，截至目前发现除胞内钙浓度之外，膜电压^[4-5]、钙调蛋白^[6-7]、氢离子^[8]、磷脂酰肌醇^[9-10]、热效应^[11]和机械效应^[12]等激活。该通道广泛表达于多种细胞，包括上皮细胞^[13-15]、血管平滑肌细胞^[16]、血管内皮细胞^[17]、心房细胞^[18]、胰腺腺泡细胞^[19]和感觉神经元^[11]等，定位于细胞膜表面^{[20, 21]}。自2008年被发现以来，亲水性分析预测TMEM16A有8个跨膜结构域^[1-3]，后2014年晶体结构分析证实该分子有10个跨膜结构域，膜的疏水核心中嵌入了一个高度保守的区域，包含一个Ca²⁺结合位点，介导TMEM16A的Ca²⁺激活^[22]（图 1）。

2 TMEM16A通道结构功能

大量研究表明，钙激活TMEM16A通道过程中存在构象变化。晶体结构显示，每个单体都有两个钙结合位点^[22]。在低钙环境（< 1 μm）下，该通道随时间缓慢激活，通道开放，产生向外的氯离子流，胞膜去极化，这个过程中膜电压发生变化，研究发现跨膜电压为正电压时促进钙与钙结合位点结合；负电压时将钙解离钙结合位点^[4]（图 2），因此通道在激活过程中可能存在至少两种构象变化以适应不同膜电压状态^[23]。晶体结构同样证实胞内钙含量较低时，可能只和位点结合一个钙离子，激活TMEM16A通道后，膜电压的改变会影响TMEM16A通道的开放状态^[22]。在低钙条件下，该通道可能在钙浓度和膜电压至少两个激活因素下被激活，以谁为主导被激活或者当一个因素已经激活该通道时，另一因素的存在是否对通道构象产生影响？目前尚无定论。但低钙环境下该通道的失活表现为随时间的快速失活特性，膜电压超极化促进钙解离钙结合位点，膜电压超极化与钙亲和力减低共同促进通道失活^[4]。在高钙环境（≥1 μm）下，胞内钙离子可充分结合至单体的钙结合位点，激活该通道，引起向外的氯离子流，但这个过程并不依赖于膜电压变化^[23]。之前研究发现钙结合位点位于膜磷脂双分子层之间的疏水区^[22]，在高钙环境下，该通道被激活后发生构象变化，钙结合位点被移至胞内侧的膜外，使通道对于膜电压的敏感度显著减低^[4]（图 2）。因此，高钙状态下通道失活表现为不依赖膜电压失活的特性^[23]。不同的钙浓度影响TMEM16A通道对不同离子的通透性^[3]，证明了不同钙浓度状态下TMEM16A通道有不同的开放状态。

3 缺血性脑卒中病理生理机制

脑缺血是由于短暂或者永久性的、局灶性或全脑血流中断，引起永久性神经功能损伤。其中缺血性脑卒中是全球致残、致死的主要原因，由大脑中动脉闭塞引起周围神经元损伤最多见^[24-26]。当发生血流中断，能量代谢紊乱、炎症、氧化应激、钙超载等机制造成脑血流动力学以及血脑屏障结构和功能异常。脑血流动力学在小动脉和微循环水平受到调节^[27-28]。因为微循环与中枢神经系统之间通过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）进行物质交换，所以脑微循环的异常更易影响神经功能预后。BBB是一种多细胞结构，包括内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞足突、基底膜，与周围神经元和胶质细胞形成神经血管单元，维持BBB的结构和功能完整至关重要。其中内皮细胞及其紧密连接是影响血脑屏障通透性的结构基础。有研究表明，Occludin和ZO-1作为内皮细胞紧密连接的标志分子^[29]，在衰老小鼠中表达明显减低^[30]，BBB功能障碍可作为衰老的早期表现^[31]，而且发现在衰老动物模型中，由于BBB功能障碍，循环免疫细胞能更大限度的游走趋化至损伤区，引发更严重的氧化应激及炎症反应^[32]。研究表明当发生缺血性脑卒中后，脑毛细血管内皮细胞表面的TMEM16A通道激活造成细胞功能障碍^[33]，表现为血脑屏障通透性升高，加重脑水肿，循环免疫细胞、血小板等物质在微循环水平淤滞，引发微血栓形成，加重脑损伤。周细胞这一概念在1920年被首次提出，称之为“收缩原件”^[34]，是指独立于微动脉的平滑肌细胞的一种收缩细胞，其作用在于稳定新生成的毛细血管^[35]、维持血脑屏障^[36]，参与脑血流的调节^[37]。毛细血管作为脑实质内血管阻力最高的位置^[38]，周细胞通过收缩调节毛细血管口径，影响局部脑灌注^{[37, 39]}。在某些生理或病理因素刺激下，配体通过G蛋白耦联受体触发胞内内质网钙库释放引起“内钙释放”胞内钙水平升高，胞内钙结合至膜内的结合位点激活TMEM16A通道^[40]，产生外向氯离子流，细胞膜发生去极化，一方面触发胞膜电压依赖性L型钙通道引起“外钙内流”，另一方面，胞内钙水平升高增加了该通道对钙敏感度^[41-42]，触发周细胞收缩^[43-44]。发生缺血性脑卒中时，血流中断，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）产生减少，能量依赖性的离子通道被抑制，引发胞内钙水平升高，触发周细胞收缩；同时在炎症、氧化应激等作用下，缩血管物质被大量释放，通过G蛋白耦联受体作用于TMEM16A，引起周细胞收缩，二者共同作用下毛细血管持续收缩，微循环长期灌注不足。且胞内钙水平持续升高发生钙超载时，会触发周细胞僵死^[45-47]，BBB功能、结构异常，循环免疫细胞进一步游走趋化，微循环出现“无复流现象”，即使溶栓及时，脑血流也无法达到有效全面灌注^[48-49]。这也反映发生缺血性脑卒中后TMEM16A通道在脑毛细血管内皮细胞和周细胞中的作用是交互的。

4 TMEM16A在缺血性脑卒中的作用

TMEM16A表达于血管内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞等，该分子不仅与癌症密切相关，最近大量研究证明，其与缺血性脑损伤有紧密联系。

4.1 TMEM16A对脑内皮细胞作用

TMEM16A表达在脑毛细血管内皮细胞（brain capillary endothelial cells，BCECs）^[50]。在生理条件下，TMEM16A正常表达可以维系BCECs胞内钙水平、静息电位的稳定^[50]。当TMEM16A表达受到抑制时，对细胞增殖迁移有抑制效应，破坏BBB屏障功能^[50]，是因为BBB的屏障功能依赖于其中细胞结构的不断更新，新细胞不断增殖，死亡细胞即使清除降解，以维持动态平衡^[51-52]。在缺氧诱导下，发现TMEM16A高表达于BCECs，并促进BCECs增殖迁移^[53]，与在生理条件下TMEM16A的作用一致。在中枢神经系统之外，发现胆固醇可以抑制人主动脉内皮细胞TMEM16A的表达，而后对内皮细胞的增殖迁移产生抑制作用^[16]，与BCECs中作用一致。其中TMEM16A影响细胞增殖迁移的分子机制目前尚无定论。最近发现，发生缺血性脑卒中后，BCECs高表达TMEM16A，并可能通过NF-κB途径促进细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、髓过氧化物酶(MPO)表达增加，BCECs通透性升高，引起BBB损伤，但通过免疫共沉淀试验发现，TMEM16A与NF-κB之间并无直接相互作用，因此其内部机制还需进一步探索^[33]。细胞间黏附分子-1表达于血管内皮细胞，调控炎症相关基因表达，介导循环免疫细胞浸润，髓过氧化物酶表达增加表示中性粒细胞激活，进一步放大炎症反应，加重脑损伤。中枢神经系统之外，血管紧张素Ⅱ构建的高血压小鼠模型中，小鼠主动脉平滑肌细胞表达TMEM16A降低，免疫共沉淀实验显示TMEM16A与p62之间存在相互作用，因此可能减弱了TMEM16A-p62之间的相互作用，增强p62与Bcl-2之间的相互作用，抑制Bcl-2-Beclin-1复合体的形成，增强Beclin-1-VPS34相互作用，引起血管内皮细胞自噬发生^[17]。当发生缺血性脑卒中后，TMEM16A在ECBCs表达上调，可能通过炎症通路如NF-κB-ICAM-1引起ECBCs通透性升高，或可能通过自噬相关通路引起ECBCs发生自噬，BBB屏障功能损伤。但TMEM16A表达升高可能影响ECBCs增殖迁移，改变BBB的屏障功能，这两种效应最终对于缺血性脑卒中到底产生怎样的影响呢？实验证明在发生缺血性脑卒中的过程中，应用TMEM16A抑制剂，降低其上调，可以减轻缺血性卒中后的脑梗死体积和改善神经功能损伤^[33]，那么对于ECBCs的增殖迁移到底产生何种影响？实验中并未进行解释。不管在中枢神经系统，还是在体内其他血管系统中，TMEM16A广泛表达于血管内皮细胞，并调控其功能。在缺血性脑卒中后，TMEM16A高表达于脑血管内皮细胞，可能通过炎症免疫或自噬等机制影响ECBCs的通透性，或者通过影响ECBCs的增殖迁移，改变血脑屏障的通透性，目前有动物实验证实脑局部应用TMEM16A抑制剂可改善双侧颈动脉闭塞的缺血性脑卒中的脑血流^[40]，但暂无相应临床试验开展，因此TMEM16A可作为治疗的缺血性脑卒中的潜在靶点，需要更深入的实验验证。

4.2 TMEM16A对脑周细胞作用

此前，大部分针对TMEM16A改善脑循环的研究集中在血管平滑肌细胞，可能通过线粒体凋亡机制^[54]、促进脑基底动脉血管平滑肌细胞的增殖迁移^{[55, 56]}、抑制细胞外基质沉积^[54]，减少血管紧张素Ⅱ诱发的高血压引起脑血管重构。高血压发生期间，由于血流动力学改变，对血管壁产生持续刺激，引发血管壁结构功能改变，因此，高血压期间脑血管重塑被认为是卒中发生的主要原因^[54]。但血管平滑肌细胞不存在终末微循环血管中，毛细血管的精细调控取决于周细胞^[57]。最近研究发现，在脑微循环中控制毛细血管管径，控制脑血流的另一种区别于平滑肌细胞的具有收缩功能的周细胞也表达TMEM16A，且在脑皮质中约90%的TMEM16A表达于周细胞，少部分表达于血管平滑肌细胞^[40]。周细胞存在于微循环的动脉端、毛细血管床及静脉端^[57]。动脉端的周细胞作为调节脑循环的关键，调节局部微循环的灌注；毛细血管床的周细胞参与维持血脑屏障通透性；静脉端周细胞可能参与循环免疫细胞的浸润^[57]。周围神经元释放谷氨酸^[58]；能量消耗增加导致乳酸、腺苷等产生增加；短期内代谢增加产生的活性氧代谢产物^[59]可以松弛周细胞，扩张毛细血管。能量消耗减少导致ATP蓄积^[60]；长期的活性氧代谢产物^[59]积累会引起周细胞收缩，微循环血量得以调节。近些年研究发现自主神经系统^{[61, 62]}、血管活性物质^{[59, 62, 63]}也参与调节周细胞收缩，调节微循环血流量。在发生缺血性脑卒中后，发现缩血管物质通过G蛋白耦联受体激活周细胞表面的TMEM16A通道引发周细胞收缩，抑制TMEM16A可以降低周细胞内钙水平，减少周细胞死亡，减弱周细胞介导的毛细血管收缩，并通过减小缺血性脑卒中后梗死面积、降低缺氧神经元比例，改善脑灌注^[40]。其中发现抑制TMEM16A可减弱周细胞收缩引起的中性粒细胞、血小板在毛细血管内停滞引起的管腔狭窄，可能作为改善脑微循环的机制^[40]。通过基因分析发现，TMEM16A表达增加与缺血性脑卒中患者神经功能预后不良相关^[40]。由此可见，在受到缩血管物质及缺血等刺激下，周细胞表达TMEM16A，作为引起微循环毛细血管收缩的信号放大器在其中发挥关键作用。当缺乏缩血管物质等的刺激时，TMEM16A活性降低^[40]，可能表明激活该通道的分子机制可能依赖于G蛋白耦联受体。发生缺血性脑损伤，缺血缺氧组织释放炎症因子、氧自由基等物质可能刺激周围组织分泌缩血管物质，通过与G蛋白耦联受体相互作用激活TMEM16A，引发向外的氯离子流，细胞去极化，激活电压依赖性的钙通道，胞内钙水平升高，与收缩蛋白相互作用，引起周细胞收缩，毛细血管微循环灌流减少，引起血流淤滞；周细胞僵死，引起BBB屏障功能损害，加重脑损伤。

5 TMEM16A在其他相关神经系统疾病

上述TMEM16A参与的病理损伤过程不仅发生在包括心肺复苏后脑损伤、脑卒中、脑出血等的引起中枢神经功能损伤^{[33, 50, 64]}，还见于以下几种疾病。神经痛作为临床上常见的慢性疼痛综合征，缺乏明确的病理生理分子机制。2008年研究表明，TMEM16A基因敲除后小鼠痛觉迟钝，并发现小鼠产生痛觉感觉时TMEM16A激活电流阈值改变^{[11, 65]}；TMEM16A可增加炎症条件下背根神经节神经元的兴奋性，加剧福尔马林介导的炎症性神经^[66-67]；在坐骨神经损伤的大鼠模型中，通过检测模型大鼠TMEM16A的表达及背根神经节神经元的兴奋性，证实了TMEM16A在持续性慢性收缩性损伤引起的痛觉过敏中起关键作用^[68-69]。因此，表明TMEM16A可能参与神经性疼痛的发生及进展。最近相关研究还发现，参与小鼠产生社会行为的犁鼻器中感觉神经元表达有TMEM16A，可能参与感知信息素，与小鼠行为异常等疾病相关^[70]。在小鼠听觉发育过程中，上行听觉网络的前感觉活动由内毛细胞自发产生的动作电位驱动，Kölliker器官的内部支持细胞的TMEM16A活性参与调整动作电位爆发的速率，因此TMEM16A还参与中枢神经系统听觉的完善^[71]。

6 TMEM16A在血管相关脑疾病中治疗前景与局限

发生脑缺血损伤之后，脑毛细血管内皮细胞胞内钙水平升高，激活TMEM16A，可能通过炎症通路如NF-κB-ICAM-1引起ECBCs通透性升高，或可能通过自噬相关通路引起ECBCs发生自噬，BBB屏障功能损伤；或者通过影响ECBCs的增殖迁移影响BBB的通透性。脑周细胞在周围炎症因子、氧自由基、缩血管物质的作用下，作用于G蛋白耦联受体，激活TMEM16A，细胞去极化引起周细胞收缩，毛细血管微循环血量严重不足，加重组织缺血缺氧损伤。在双侧颈总动脉闭塞模拟严重的缺血性脑卒中小鼠模型中，抑制TMEM16A可能通过抑制周细胞持续收缩或僵死，改善微循环灌注，达到尽早恢复脑血流，减轻脑损伤的效果。但局限性有：(1)目前治疗性的TMEM16A抑制剂暂未上市，进一步了解TMEM16A结构有助于构建通道结构功能的抑制剂，并保证其血脑屏障的通透性，更好地发挥治疗效应，减少不必要的副作用。(2)发生缺血性脑卒中后，在应用TMEM16A抑制剂后脑毛细血管内皮TMEM16A表达下调，总的来看，对于脑梗死的体积和神经功能损伤有改善效果，但在中枢毛细血管中TMEM16A表达下调可能不利于ECBCs的增殖迁移，而ECBCs的增殖迁移对于稳定血脑屏障结构有重要意义，因此其中的机制还需进一步通过实验验证讨论。(3)TMEM16A通道在肿瘤相关研究中一直较为热衷，最近发现其在血管相关疾病中发挥作用。本文叙述了TMEM16A在缺血性脑卒中发挥的作用，而对于全脑缺血的模型——目前亟待解决的心脏骤停后脑复苏方面是否有治疗意义：改善微循环灌注、炎症氧化应激等损伤造成的BBB通透性升高，无疑是改善神经功能损伤预后的关键环节，TMEM16A是否能作为心脏骤停患者脑损伤的治疗靶点之一？仍需通过进一步的实验探索。

利益冲突   所有作者声明无利益冲突