2024, Vol. 33
脓毒症是机体对于感染失控反应所导致危及生命的器官功能障碍，在ICU中发病率高。脓毒症的致病病原体包括细菌、病毒、真菌，多是以细菌为主。病原体可通过呼吸道、消化道、泌尿道、创口等部位入血，引发血流感染，增加患者病死率。对于脓毒症的治疗，在Sepsis 3.0中提出了集束化的治疗策略，建议在怀疑脓毒症的早期大量补液，同时完善血培养并经验性加用抗生素。越早使用有效的抗感染方案，患者病死率越低[1-2]。在临床工作中，早期多是根据可能的感染来源经验性制定抗感染方案，最终是否调整抗感染方案需参考血液病原学结果。但目前，大部分研究显示血培养阳性率10%~40%不等[3-4]，仍有部分脓毒症患者不能通过血培养及时获取病原学依据。mNGS是近年来广泛应用的一种病原学检测方法，其可对标本中所有微生物进行基因检测, 并通过分析识别出病原体。与传统的检测方法不同, mNGS具有快速鉴定、全面覆盖、灵敏度高等特点, 因此在重症医学科的临床工作中有较高的应用价值。本研究对mNGS在ICU收治的脓毒症患者的病因学诊断中的应用进行了综合分析，为脓毒症患者病情的分析及治疗提供依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象本研究回顾性收集2021年9月至2023年8月在川北医学院附属医院ICU住院期间行mNGS检查的105例脓毒症病例的临床资料。其中男55例，女50例。病例纳入标准：（1）临床诊断为脓毒症，符合Sepsis 3.0诊断标准：①高度可疑的感染；②SOFA评分＞2分。（2）入重症医学科同一时间段完善了血液mNGS、血培养、血沉（ESR）、PCT、C-反应蛋白（CRP）、血常规检测的患者。排除标准：①血培养及mNGS结果考虑为污染或临床资料不完整的患者。②研究中病原体检测结果的解读由3名高级职称医师共同商议后决定，但最终对于检测出病原体是否有价值意见不统一的病例。本研究经川北医学院附属医院药物临床试验伦理委员会批准（批件号：2022ER286-1）。
1.2 数据收集及分组通过本院电子病历系统收集入选病例的基本信息，包括性别，年龄，生活史，APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、基础疾病情况、感染来源，收集并统计入重症医学科后血mNGS、血培养、实验室检查、病情严重程度、治疗及预后情况的数据。根据mNGS及血培养有无阳性结果将病例分为两组，阳性组及阴性组。这些数据由3名具备高级职称的ICU医生进行了审查。
1.3 血标本实验室检测方法由护士同时抽取血样本送检，行血培养、ESR、PCT、CRP、血常规的样本送至本院检验科行检测。血培养的采集参照美国临床试验标准化协会的血培养实践指南执行，从不同部位穿刺，采集2套标本分别注入需氧瓶和厌氧瓶进行送检、培养。
1.4 mNGS检测用于送检mNGS的血液样本使用K管采集（约5~10 mL、6至35℃储存)，所有血标本的mNGS由广州微远基因科技有限公司完成。样品在收集后8h内离心10 min（1 600 g、4℃）。待细胞及血浆分层后取血浆至无菌管，DNA提取试剂盒提取DNA, 使用DNA检测试剂盒进行扩增，通过断裂、末端修复、适配器连接和PCR扩增，建立DNA文库。扩增之后使用IDseqTMUltra技术测序。非人类序列在减去人类宿主序列映射到人类参考基因组后被读取，其余数据与微生物基因组数据库进行比较。对映射数据进行处理和分析，列出疑似病原体，包括reads数、覆盖率和相对丰度、置信度等。
1.5 统计学方法实验数据采用统计学软件SPSS 22.0进行分析处理, 符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用独立样本的t检验；非正态分布的多组之间的均数及单向有序分类资料比较采用Kruskal-Wallis秩合检验，二分类资料分析采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 患者基线资料本研究中符合入组标准的脓毒症病例共计105例，其中男55例，女50例。表 1显示了接受血液mNGS及血培养检测的患者的人口统计学特征、生活史、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、基础疾病情况、感染源。从61份（58.10%）血液样本中检测到病原体，44份（41.90%）样本检测为阴性结果，即mNGS单阳、mNGS和血培养双阳的血液标本之和为61份，mNGS和血培养双阴的血液标本为44份。两组病例间在人口统计学特征、生活史、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、基础疾病情况、感染源等方面差异无统计学意义(P > 0.05)，见表 1。
| 指标 | 所有患者（n=105） | 阳性组（n=61） | 阴性组（n=44） | P值 |
| 性别（n, %） | 0.429 | |||
| 男 | 55（52.38） | 31（50.82） | 24（54.55） | |
| 女 | 50（47.62） | 30（49.18） | 20（45.45） | |
| 年龄(岁, x±s) | 68.2±14.99 | 59.17±18.62 | 64.31±19.25 | 0.195 |
| 生活史（n, %） | ||||
| 吸烟 | 55（52.38） | 31（50.82） | 24（54.55） | 0.429 |
| 饮酒 | 40（38.10） | 26（42.62） | 14（31.82） | 0.179 |
| 评分（x±s） | ||||
| APACHEⅡ评分 | 32.15±11.37 | 35.44±13.98 | 25.34±9.69 | 0.217 |
| SOFA评分 | 6.72±5.14 | 7.95±9.72 | 5.05±3.06 | 0.265 |
| 基础性疾病数量（n, %） | 0.043 | |||
| 0 | 39（37.14） | 19（31.15） | 20（45.45） | |
| 1 | 52（49.53） | 36（59.02） | 16（36.36） | |
| ≥ 2 | 14（13.33） | 10（16.39） | 4（9.09） | |
| 基础性疾病（n, %） | 0.288 | |||
| 神经系统疾病 | 5（4.76） | 3（4.91） | 2（4.55） | |
| 心血管系统疾病 | 60（57.14） | 39（63.93） | 21（47.73） | |
| 肾功能不全 | 7（6.67） | 5（8.20） | 2（4.55） | |
| 糖尿病 | 43（40.95） | 25（40.98） | 18（40.91） | |
| 其他 | 11（10.48） | 5（8.20） | 6（13.64） | |
| 感染源（n, %） | 0.267 | |||
| 肺 | 74（70.48） | 40（65.57） | 34（77.27） | |
| 腹腔 | 33（31.43） | 19（31.15） | 14（31.82） | |
| 泌尿道 | 7（6.67） | 1（1.64） | 6(13.64) | |
| 皮肤软组织 | 2（1.90） | 0（0.00） | 2(4.55) |
统计阳性组病原体检测结果发现，mNGS检出的最常见的潜在病原体是细菌(n=44)，其中检出革兰氏阴性菌的为31例（77.55%），革兰氏阳性菌的11例（22.45%）。阴性菌位居榜首的是大肠埃希菌(n=14)，其次是肺炎克雷伯菌(n=10)。阳性菌位居榜首的是屎肠球菌(n=7)，其次是金黄色葡萄球菌(n=3)。此外，部分病例还检出部分真菌、鹦鹉热衣原体、病毒。25例mNGS阳性患者被发现是混合感染，包括多种细菌、真菌等的混合感染，见图 1。
|
| 图 1 血培养及mNGS阳性的样本病原学检出情况 Fig 1 Pathogenetic detection of blood cultures and mNGS positive samples |
|
|
患者入重症医学科后，在同一时间段取静脉血分别送检血培养等检查及mNGS，对符合mNGS及血培养阳性标准的所有病例进行了计数。105个病例中，61例mNGS有阳性结果，32例血培养有阳性结果。两种检测方法相比较，mNGS的阳性率高于血培养[61(58.10%) vs. 32(30.48%)，P < 0.05]。61个mNGS阳性病例中，其中有7例的病原体为人类疱疹病毒或细环病毒，经综合分析后不存在临床参考价值，而32例血培养阳性的病例的病原结果均有临床意义。两种检测方法相比较，血mNGS准确率低于血培养[54(88.52%) vs. 32(100%)]，见表 2。
| 检测方法 | 合计 | 阳性率 | 准确率 |
| 血液mNGS | 105 | 61/105（58.10） | 54/61（88.52） |
| 血液培养 | 105 | 32/105（30.48） | 32/32（100） |
根据血mNGS和血培养结果将入组病例分为mNGS和血培养双阳、mNGS单阳、血培养单阳、mNGS和血培养双阴4类。其中mNGS及血培养双阳的病例有32例(30%)，mNGS单阳的病例有29例(28%)，mNGS及血培养双阴的病例有44例(42%)，无血培养单阳病例。分析mNGS及血培养双阳病例的病原体结果，mNGS和血培养结果完全一致的病例有18例(56%)，mNGS和血培养结果部分一致的有14例(44%)，见图 2。
|
| 图 2 血培养及mNGS结果及一致性分析 Fig 2 Results and consistency analysis of the blood culture and mNGS |
|
|
在完善血培养及血mNGS同一时间段行ESR、PCT、CRP、血常规等检测，结果显示，各组间白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数等差异无统计学意义（P＞0.05）。两组病例间ESR、CRP及PCT的均值均不相同。阳性组ESR、CRP及PCT的水平显著高于阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。阳性组发展为脓毒性休克及MODS的病例的比例高于阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05），但各组间患者住院病死率及出院后28 d病死率差异不大，住ICU时间及住院总花费差异无统计学意义，见表 3。
| 指标 | 总体（n=105） | 阳性组（n=61） | 阴性组（n=44） | P值 |
| 实验室检测 | ||||
| 白细胞计数(x±s) | 18.77±8.59 | 16.05±7.43 | 16.12±9.28 | 0.106 |
| 中性粒细胞计数(x±s) | 14.14±6.39 | 13.25±6.28 | 13.07±9.55 | 0.194 |
| 淋巴细胞计数(x±s) | 3.61±2.45 | 2.98±3.42 | 2.95±1.83 | 0.121 |
| ESR（mm/h, x±s） | 56.11±49.02 | 69.64±112.55 | 34.37±26.52 | 0.046 |
| CRP（mg/L, x±s） | 154.27±50.61 | 196.43±70.08 | 102.56±50.22 | 0.000 |
| PCT（ng/mL, x±s） | 21.48±29.16 | 51.77±28.91 | 5.97±4.33 | 0.000 |
| 病情严重程度（n，%） | ||||
| 脓毒性休克 | 50(47.62) | 41(67.21) | 9（20.45） | 0.000 |
| MODS | 22(20.95) | 17(27.87) | 5（11.36） | 0.033 |
| 治疗措施 | ||||
| 机械通气（n，%） | 100(95.24) | 59(96.72) | 41(93.18) | - |
| 机械通气时长 | 9.63±5.41 | 9.97±6.42 | 8.11±7.42 | 0.654 |
| 是否根据mNGS调整抗生素（n，%） | 38(36.19) | 38(62.30) | 0(0) | 0.000 |
| 预后（n，%） | ||||
| 住院病死率 | 15(14.29) | 12(19.67) | 3（6.82） | 0.627 |
| 28 d病死率 | 41(39.05) | 33(54.10) | 8（18.18） | 0.055 |
| ICU时长(x±s) | 10.79±7.55 | 10.89±7.53 | 10.65±7.77 | 0.665 |
| 住院总花费(x±s) | 154353.17±46782.18 | 128 171.06±58 421.44 | 178 909.24±45 359.72 | 0.945 |
重症医学科的患者多合并严重的感染，包括肺、腹腔、泌尿道、血流感染等，血流感染的患者病情更为凶险，病死率可达35%[5]。血培养是诊断脓毒症患者血流感染的“金标准”，但血培养存在耗时较长、阳性检出率低等缺点。mNGS是一种是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术，具有速度快、覆盖病原微生物范围广等优势，近年来在临床上得到推广，在感染性疾病的诊断中具有较高的应用价值[6-7]。mNGS为定量检测，检测结果的病原体序列数量越高, 样本培养的阳性率越高, mNGS检测的序列数一定程度上能反映病原体的载量[8]。同时mNGS对病毒、非典型病原体等诊断具有优势，有利于多重感染的鉴定[9-10]。本研究纳入了105例怀疑血流感染的病例，研究结果显示mNGS具有更高的阳性率, 是血培养等传统检测方法的补充。
传统微生物检验结果的流行病学调查显示，血流感染的致病菌主要为G-菌，其次为G+菌、真菌等。随着mNGS的发展，发现了更多的病毒感染，分析原因可能与患者体内潜伏的病毒激活有关。为了早期获取病原学依据、提高病原体检出率，更精准的使用抗感染药物，本研究入组病例送检血培养的同时完善了血液mNGS。血液mNGS及血培养双阳的病例有32例，检出病原体包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌。32例中mNGS和血培养结果完全一致的有18例, 14例mNGS和血培养结果不完全一致病例，mNGS还检出了病毒及真菌，包括白色念珠菌、耶氏肺孢子菌、咽峡炎链球菌、副流感嗜血杆菌、小韦荣球菌、产气荚膜梭菌、惰性凝聚杆菌、新型冠状病毒、人类疱疹病毒等。整体上来看，mNGS的检出结果几乎可以覆盖血培养的检出结果，还能弥补血培养不足，提高病原体的检出效率。例如对于真菌、病毒、特殊病原体、厌氧菌和常规血培养培养较困难的细菌，mNGS检测具有其独特的优势。
此外，分析所有病例检出的病原体发现，血流感染中细菌感染仍居于首位，这一结果与张淋等[8]的研究结果基本一致。阴性菌中大肠埃希菌感染率位居榜首，之后依次是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌，阳性菌则以金黄色葡萄球菌和屎肠球菌居多。该趋势可能与本院病原体流行学分布特点有关。值得重视的是，黄曲霉、烟曲霉、耶氏肺孢子菌、白色念珠菌的感染率在增加，这可能与ICU患者病情重、长期大量使用抗生素等因素有关。mNGS检测灵敏度较高，这也意味着环境、试剂、容器中的微生物污染和人体定植的微生物将影响检测结果。无论是肺泡灌洗液，还是血液，都可检出非致病病原体序列。因此，对于测序结果为阳性的报告可根据病例临床特点、实验室及辅助检查结果综合分析。在本研究中，对于有肺部、尿路感染的病例，mNGS虽检测出人类疱疹病毒、细环病毒等，但并没有考虑抗病毒，而是积极针对原发部位的感染进行治疗，并积极搜寻局部的病原学依据。对于血液mNGS检出细菌、衣原体的病例，结合病情的严重程度，即使是检测出较小序列数的病原体，也是具有价值的，可为临床治疗提供指导。
有研究显示mNGS检测敏感度为72.7%, 相比单纯血培养而言, mNGS的阳性率更高。尤其是对于脓毒性休克患者，早期mNGS的阳性率明显高于血培养。目前本院mNGS报告的时间为24 h左右，较血培养更加快速、高效。本研究也显示mNGS的阳性率为58.10%，明显高于血培养阳性率30.48%。血培养阳性的病例检出的病原体均具有临床价值，而mNGS阳性的病例中有7例仅检出单纯疱疹病毒、细环病毒，且病毒序列数不高，经综合评估后不具有临床意义。因此本研究结果显示，mNGS的准确率略低于血培养的准确率。
mNGS为单阳病例为29例，检出了细菌、真菌、衣原体、病毒。针对这些病例，在入ICU后1 h内根据可能感染来源经验性应用了抗生素，部分病例根据mNGS结果进行了抗感染方案的调整。对比阳性和阴性组ESR、PCT和CRP的水平发现，前者ESR、PCT和CRP的均数均高于后者，且前者发展为感染性休克的比例也高于后者。由此可以推断，阳性组的病例炎性反应及感染的程度更重。44例阴性的病例，ESR、PCT及CRP的检测值仍明显高于正常值的上限，部分病例仍存在休克的表现，考虑病原体可能未入血，也可能与mNGS及血培养阴性结果与两种检测方法的敏感性、血液病原体的浓度等因素有关。针对以上病例继续予以经验性抗感染治疗，通过获取痰、尿等标本进一步搜寻病原学依据。阳性组病例病情更为严重，但两组病例的住院存活率、离院28 d患者的病死率却差异不大。这可能与感染重的病例的病原体被及时检测出、及时依据mNGS和血培养更换抗感染方案有关。因此，及时获取病原学依据在很大程度上改善了重症血流感染患者的预后，mNGS也作为一项有价值的检测方式，提高了病原学检出率。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献申明 尹云玉：论文撰写、数据收集；丁雪峰、王大庆、葛颖：数据分析；陈丽：论文修改
| [1] | Usher MG, Tourani R, Webber B, et al. Patient heterogeneity and the J-curve relationship between time-to-antibiotics and the outcomes of patients admitted with bacterial infection[J]. Crit Care Med, 2022, 50(5): 799-809. DOI:10.1097/CCM.0000000000005429 |
| [2] | Umemura Y, Abe T, Ogura H, et al. Hour-1 bundle adherence was associated with reduction of in-hospital mortality among patients with sepsis in Japan[J]. PLoS One, 2022, 17(2): e0263936. DOI:10.1371/journal.pone.0263936 |
| [3] | Tajima T, Asai Y, Endo M, et al. Rate of blood culture submissions in Japan as an indicator of bloodstream infections[J]. J Infect Chemother, 2021, 27(8): 1270-1272. DOI:10.1016/j.jiac.2021.04.019 |
| [4] | Lin PC, Chang CL, Chung YH, et al. Revisiting factors associated with blood culture positivity: critical factors after the introduction of automated continuous monitoring blood culture systems[J]. Medicine, 2022, 101(30): e29693. DOI:10.1097/MD.0000000000029693 |
| [5] | Vincent JL, Donadello K, Schmit X. Biomarkers in the critically ill patient: C-reactive protein[J]. Crit Care Clin, 2011, 27(2): 241-251. DOI:10.1016/j.ccc.2010.12.010 |
| [6] | 马潇枭, 牟干, 刘玲, 等. 感染性病原体二代测序技术研究进展[J]. 中华医院感染学杂志, 2021, 31(11): 1754-1760. DOI:10.11816/cn.ni.2021-206672 |
| [7] | 宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用共识专家组, 中国研究型医院学会脓毒症与休克专业委员会, 中国微生物学会微生物毒素专业委员会, 等. 宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)[J]. 感染、炎症、修复, 2020, 21(2): 75-81. DOI:10.3969/j.issn.1672-8521.2020.02.002 |
| [8] | 张淋, 洪城, 孟新科, 等. 宏基因组学第二代测序技术对比传统实验室微生物培养在脓毒症病原学诊断中的优势[J]. 中国急救医学, 2022, 42(2): 114-120. DOI:10.3969/j.issn.1002-1949.2022.02.005 |
| [9] | Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics[J]. Nat Rev Genet, 2019, 20(6): 341-355. DOI:10.1038/s41576-019-0113-7 |
| [10] | Miao Q, Ma YY, Wang QQ, et al. Microbiological diagnostic performance of metagenomic next-generation sequencing when applied to clinical practice[J]. Clin Infect Dis, 2018, 67(suppl_2): S231-S240. DOI:10.1093/cid/ciy693 |