2024, Vol. 33
2. 宁夏回族自治区干细胞与再生医学重点实验室，银川 750004;
3. 宁夏医科大学总医院重症医学科, 银川 750004
2. Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750004, China;
3. Department of Critical Care Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是肺泡上皮细胞、肺毛细血管内皮细胞死亡导致肺泡-毛细血管屏障破坏的疾病[1]。ALI的发病率和病死率较高，而临床上有效的ALI治疗方法却有限[2]。研究表明，调节巨噬细胞极化方向，可以改善ALI的炎症反应[3]。巨噬细胞可以分为两种主要的表型，经典激活的巨噬细胞(M1)由Th1细胞因子引发, 例如脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)诱导并产生高水平的促炎细胞因子白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）等, 相关极化指标白细胞分化抗原86（CD86）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）增加；相反, 可替代激活的巨噬细胞(M2)是由Th2细胞因子引发，例如白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素13（IL-13）诱导并产生高水平抑炎细胞因子转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素10（IL-10）等，相关极化指标巨噬细胞甘露糖受体（CD206）、精氨酸酶1（ARG-1）增加[4-6]。有研究发现，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1（HO-1）通路激活，可以改变巨噬细胞极化方向[7-8]。但是AMPK/Nrf2/HO-1是否调节肺泡巨噬细胞极化，尚不清楚。
肠道微生物群是一个多样化的菌群落，前期研究肠-肺轴时发现血液、肺组织、以及肠道的菌群分布存在部分重合[9]。这些菌群通过发酵将纤维分解成更简单的化合物，其中就包括短链脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)，肠道中产生的SCFA主要是乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐[10]。SCFA具有多种功能，如免疫调节、抗肿瘤、巨噬细胞极化、炎症方面有着重要作用[11]。丁酸钠（sodium butyrate，NaB）是研究最广泛的SCFA，有研究发现，NaB在神经、消化系统都发挥着抗炎的作用[12-13]，还有研究发现，NaB可以通过G蛋白偶联受体43（GPR43）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）调节巨噬细胞极化方向，缓解炎症反应[14]。AMPK是一种异源三聚体蛋白复合物，参与调节细胞能量代谢[15]。磷酸化的AMPK引发多效性作用，包括增加分解和减少合成代谢、改善内皮功能、减少炎症或改善氧化还原平衡[16]；AMPK和Nrf2通路之间存在相互作用，激活的AMPK使Nrf2多个丝氨酸位点磷酸化，促使其在核内聚集[17]，HO-1是Nrf2重要的下游抗氧化因子，HO-1及其产物通过抗氧化损伤、调节细胞凋亡、调节炎症和和促进血管生成发挥有益的作用。NaB是否通过AMPK/Nrf2/HO-1调节M1型肺泡巨噬细胞极化，缓解ALI炎症反应不明。本研究通过采用LPS刺激体外培养小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）构建M1型肺泡巨噬细胞极化模型，研究NaB对LPS引起M1型肺泡巨噬细胞炎症分子的表达及极化表型的影响，以探讨SCFA调节肺泡巨噬细胞极化的机制, 为ALI提供新的有效治疗方法。
1 材料与方法 1.1 细胞、试剂和仪器小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，小鼠肺上皮细胞（MLE-12）购自苏州海星生物科技有限公司，置于37℃, 5%CO2培养箱中孵育；丁酸钠（NaB）、脂多糖（LPS）（索莱宝，北京，中国），Compound C（AMPK抑制剂）（APExBIO，美国），总RNA提取试剂盒（Omega, 美国），逆转录试和扩增试剂盒（TaKaRa，日本），酶联免疫吸附试剂盒（晶美，江苏，中国），小鼠流式抗体F4/80 PE、CD86 FITC、iNOS BV421（Invitrogen，美国），P-AMPK、Nrf2、HO-1抗体（塞维尔，武汉，中国），AMPK抗体（爱博泰克，武汉，中国）；定量PCR仪（BIO－RAD，上海，中国），流式细胞仪（BD，美国)。
1.2 MH-S细胞处理和分组取对数生长的MH-S细胞，以2×106/孔细胞接种于六孔板，用LPS刺激MH-S细胞构建M1型巨噬细胞极化模型。实验分组：对照组（control组）、NaB组（1 mmol/L NaB处理细胞24 h）、LPS组（1 000 ng/mL LPS处理细胞24 h）、LB组（预先用1 mmol/L NaB处理细胞0.5 h，再用LPS处理细胞24 h）、LC组（预先用10 μmol/L Compound C（AMPK抑制剂）处理细胞0.5 h，再用NaB处理0.5 h，最后LPS处理细胞24 h）。
1.3 MH-S细胞上清液和MLE-12细胞共培养MH-S细胞分为Control、NaB、LPS、LB组，24 h后收集上清液，再和MLE-12细胞共培养24 h，收集MLE-12细胞进行闭锁小带蛋白1（ZO-1）、紧密连接蛋白4（Claudin-4）、闭合蛋白（Occludin）的qRT-PCR实验。
1.4 实时荧光定量（qRT-PCR）检测分组培养细胞后，收集细胞，用总RNA提取试剂盒提取RNA, 测定样品纯度与浓度。逆转录后用定量PCR试剂盒检测相关基因表达。上海生工生物科技有限公司设计引物, 序列见表 1。
| 基因 | 引物序列（5，-3，） |
| IL-6 | |
| 正向 | TTCTTGGGACTGATGCTG |
| 反向 | CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT |
| TNF-α | |
| 正向 | TGTCCCTTTCACTCACTGGC |
| 反向 | CATCTTTTGGGGGAGTGCCT |
| IL-1β | |
| 正向 | GCAACTGTTCCTGAACTCAACT |
| 反向 | ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT |
| CD86 | |
| 正向 | CAGCACGGACTTGAACAACC |
| 反向 | CTCCACGGAAACAGCATCTGA |
| iNOS | |
| 正向 | CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAG |
| 反向 | GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTG |
| ZO-1 | |
| 正向 | CGTTCCGGGGAAGTTACGTG |
| 反向 | GTGGGACAAAAGTCCGGGAA |
| Occludin | |
| 正向 | GTGAGCACCTTGGGATTCCG |
| 反向 | ACATGGCTGATGTCACTGGT |
| Claudin-4 | |
| 正向 | TCTACAACCCTATGGTGGCTTCC |
| 反向 | ACTTGGCCGAGTAGGGCTTGTC |
| β-actin | |
| 正向 | GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG |
| 反向 | ATGCCACAGGATTCCATACC |
| 注：IL-6为白细胞介素6、TNF-α为肿瘤坏死因子α、IL-1β为白细胞介素1β、CD86为白细胞分化抗原86、iNOS为诱导型一氧化氮合酶、ZO-1为闭锁小带蛋白1、Occludin为闭合蛋白、Claudin-4为紧密连接蛋白4、β-actin为β-肌动蛋白 | |
分组收取上清液后，严格按照试剂盒说明操作，测定上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。
1.6 流式细胞术分析分组收集细胞后, 加入预冷的Stain Buffer（FBS）, 4℃, 1 200 rpm, 5 min, 离心弃上清液；100 μL Stain Buffer（FBS）重悬细胞, 加入Fc受体阻断剂，4℃避光孵育15 min, 清洗; 50 μL Stain Buffer（FBS）重悬细胞, 加入流式抗体F4/80 PE、CD86 FITC, 4℃避光孵育0.5 h, 清洗; 50 μL Stain Buffer（FBS）重悬细胞, 加入破膜试剂，4℃避光孵育20 min，清洗；50 μL 1×BD Perm/WashTM Buffer重悬细胞，加入流式抗体iNOS BV421，4℃避光孵育0.5 h，清洗；Stain Buffer（FBS）重悬细胞上机，Flowjo 10.8.1软件分析。
1.7 Western blot分析细胞提取蛋白, 用BCA检测试剂盒测蛋白浓度；SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，这些膜在室温下与含5%脱脂牛奶的TBST孵育1 h，TBST漂洗3次后；膜用以下特异性Ⅰ抗4 ℃孵育过夜：P-AMPK、AMPK、Nrf2、HO-1、GAPDH、a-Tubulin、Histone H3抗体(1∶ 1 000)；然后, TBST漂洗3次后用Ⅱ抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST漂洗3次后用增强型化学发光试剂使印迹可视化。采用ImageJ软件进行条带灰度值分析。
1.8 统计学方法所有实验重复三次(n=3)，采用GraphPad Prism 9.4.1软件进行统计分析, 数据均采用均数±标准差（x±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析, 而组间两两比较采用Tukey法检验, 以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 NaB可以改善LPS诱导的MH-S细胞炎症反应为确定NaB是否影响LPS诱导的MH-S细胞的炎症反应，qRT-PCR检测M1型巨噬细胞相关促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平（表 2）。与Control组相比，NaB组差异无统计学意义，LPS组IL-6、IL-1β、TNF-α促炎细胞因子表达显著增高（均P＜0.05）；与LPS组比，LB组加入NaB后促炎细胞因子显著降低（均P＜0.05）。此外，对细胞上清液相关炎症因子蛋白含量测定发现，炎症因子水平变化与其相应的mRNA表达趋势基本一致（表 2）。以上结果表明，NaB可降低M1型肺泡巨噬细胞相关促炎因子分泌。
| 组别 | qRT-PCR | ELISA | |||||
| IL-6 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-1β | TNF-α | ||
| Control组 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 0.53±0.25 | 15.74±0.70 | 219.80±9.14 | |
| NaB组 | 1.05±0.29 | 1.09±0.20 | 3.84±3.73 | 0.34±0.19 | 15.32±0.24 | 216.40±4.34 | |
| LPS组 | 238.70±11.62a | 536.80±112.20a | 28.17±7.83a | 63.83±0.16a | 58.76±0.76a | 393.00±1.93a | |
| LB组 | 129.70±4.44b | 361.50±34.02b | 9.44±7.30b | 44.83±0.89b | 32.38±1.17b | 192.90±14.18b | |
| 注：IL-6为白细胞介素6、IL-1β为白细胞介素1β、TNF-α为肿瘤坏死因子α；与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05 | |||||||
为确定NaB调节LPS诱导的MH-S细胞的极化方向，qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标记物CD86、iNOS的mRNA表达水平(表 3)。与Control组相比，NaB组差异无统计学意义，LPS组CD86、iNOS表达水平显著增高（均P＜0.05）；但与LPS组相比，LB组加入NaB后CD86、iNOS表达水平显著降低（均P＜0.05）。此外，流式细胞术测定F4/80+CD86+、iNOS+的水平，如图 1所示，与qRT-PCR结果基本一致。以上结果表明，NaB可以改变LPS诱导的MH-S细胞极化方向，具体为抑制M1型肺泡巨噬细胞极化。
| 组别 | CD86 | iNOS |
| control组 | 1.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 |
| NaB组 | 1.02 ± 0.05 | 0.70 ± 0.09 |
| LPS组 | 4.20 ± 0.57a | 220.70 ± 6.25a |
| LB组 | 0.99 ± 0.06b | 132.20 ± 17.12b |
| 注：CD86为白细胞分化抗原86、iNOS为诱导型一氧化氮合酶；与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05 | ||
|
| 各组F4/80+CD86+、iNOS+表达变化; 与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05 图 1 NaB抑制M1型肺泡巨噬细胞极化 Fig 1 NaB inhibits polarization of M1 type alveolar macrophages |
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为确定NaB是否通过AMPK/Nrf2/HO-1信号通路抑制M1型肺泡巨噬细胞极化，首先，Western blot检测各组AMPK、P-AMPK、Nrf2（nucleus）和HO-1的蛋白表达水平，如图 2A所示。与Control组相比，NaB组P-AMPK/AMPK、Nrf2（nucleus）、HO-1的蛋白水平显著增高（均P＜0.05），LPS组差异无统计学意义；与LPS组相比，LB组加入NaB增高了P-AMPK/AMPK、Nrf2（nucleus）、HO-1的蛋白表达（均P＜0.05）；但与LB组相比，LC组加入AMPK抑制剂Compound C后P-AMPK/AMPK、Nrf2（nucleus）、HO-1的蛋白水平显著降低（均P＜0.05）。然后，流式细胞术测定iNOS+表达结果如图 2B所示，与Control组相比，NaB组差异无统计学意义，LPS组iNOS+的表达显著增高（P＜0.05）；与LPS组相比，LB组加入NaB后iNOS+的表达显著降低（P＜0.05）；但与LB组相比，LC组加了AMPK抑制剂Compound C后逆转了NaB对iNOS+的抑制作用（P＜0.05）。以上结果证实，NaB通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路抑制M1型肺泡巨噬细胞极化。
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| A：MH-S细胞中各组AMPK、P-AMPK、Nrf2（nucleus）、HO-1的蛋白表达变化；B：流式细胞术测定MH-S细胞中各组iNOS+的表达变化；其中与Control组比较，aP＜0.05;与LPS组比较，bP＜0.05;与LB组比较，cP＜0.05 图 2 NaB通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路抑制M1型肺泡巨噬细胞极化 Fig 2 NaB inhibits M1 type alveolar macrophage polarization by activating the AMPK/Nrf2/HO-1 signaling pathway |
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通过共培养，qRT-PCR检测MLE-12细胞Z0-1、Claudin-4、Occludin的mRNA表达水平（表 4）。与Control组相比，NaB组差异无统计学意义，LPS组Z0-1、Claudin-4、Occludin表达水平显著降低（均P＜0.05）；但与LPS组相比，LB组加入NaB后Z0-1、Claudin-4、Occludin表达水平显著升高（均P＜0.05）。以上结果表明，NaB抑制了M1型MH-S细胞极化，逆转了MLE-12细胞紧密连接蛋白水平的降低。
| 组别 | Z0-1 | Claudin-4 | Occludin |
| Control组 | 1.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 |
| NaB组 | 0.86 ± 0.19 | 0.95 ± 0.05 | 0.94 ± 0.05 |
| LPS组 | 0.36 ± 0.13a | 0.21 ± 0.03a | 0.43 ± 0.12a |
| LB组 | 0.81 ± 0.18b | 0.97 ± 0.03b | 0.92 ± 0.03b |
| 注：ZO-1为闭锁小带蛋白1、Claudin-4为紧密连接蛋白4、Occludin为闭合蛋白；与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05 | |||
ALI是由严重感染、创伤或多种直接、间接因素引起肺组织发生病变所导致的严重的急性呼吸道疾病[18]。ALI主要表现为肺水肿和肺部炎症反应, 出现急性和进行性缺氧性呼吸衰竭；随着ALI的进展, 肺泡的气体交换能力会随着肺部炎症介质的积累而不断下降, 最终导致呼吸衰竭进而危害生命安全。目前，ALI的治疗主要集中在肺保护策略和激素治疗等方法, 缺乏特异性疗法及药物。肠-肺轴理论已经证实，肠道来源的SCFA可通过肠-肺轴影响肺中的免疫环境[19]，研究发现NaB在CLP模型的小鼠中可以改善肺部炎症反应，机制可能与调节巨噬细胞极化有关。本实验进行的体外细胞实验研究结果也证实加入NaB的LB组，与LPS组相比，M1型肺泡巨噬细胞中促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达降低。
肺泡巨噬细胞在肺部疾病中有着重要的作用，因此调节肺泡巨噬细胞的极化可能是ALI的一个潜在的合理的治疗靶点。有研究表明，NaB调节LPS诱导的RAW264.7细胞极化方向，缓解酒精性肝病的炎症反应，还有研究表明，NaB调节LPS诱导的小鼠BMDM细胞极化方向，缓解非酒精性脂肪性肝炎。但是NaB调节MH-S细胞极化方向与ALI尚未研究。研究发现, 与Control组相比，LPS组CD86、iNOS显著升高；与LPS组相比，LB组加入NaB后CD86、iNOS显著降低，以上结果表明，NaB可以改变LPS诱导的MH-S细胞极化方向，具体为抑制M1型肺泡巨噬细胞极化。但是NaB调节肺泡巨噬细胞极化的作用机制有待进一步研究。
AMPK存在于所有真核细胞中，是细胞能量的调节器，可因三磷酸腺苷（ATP）消耗而激活，如氧化应激、代谢中毒等。众多研究发现，AMPK与巨噬细胞极化关系密切。AMPK可通过磷酸化等方式上调核Nrf2，增加HO-1表达水平，产生多种效应。有研究表明，AMPK/Nrf2/HO-1信号通路激活调节RAW264.7、BMDM细胞极化方向。通路研究同样也发现，与LPS相比，LB组加入NaB后可以促进P-AMPK/AMPK、Nrf2（nucleus）、HO-1的表达；为了确定上下游关系，加入了AMPK抑制剂Compound C，与LB组相比，LC组降低了P-AMPK/AMPK、Nrf2（nucleus）、HO-1的表达；另外，流式细胞术结果显示，与LPS相比，LB组加入NaB后可以抑制iNOS+的表达；与LB组相比，LC组逆转了NaB对iNOS+的抑制作用。同时，MH-S细胞分组后上清液和MLE-12细胞共培养，检测MLE-12细胞紧密连接蛋白的mRNA表达, 与Control组相比，LPS组Z0-1、Claudin-4、Occludin的表达降低；与LPS组比较，LB组加入NaB后，Z0-1、Claudin-4、Occludin的表达被逆转增高，细胞层面表明NaB抑制M1型肺泡巨噬细胞极化，改善了肺上皮细胞的损伤。这些实验充分说明了NaB通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路，抑制M1型肺泡巨噬细胞，改善了炎症反应。
本实验还有局限之处，本研究只探讨了NaB对M1型肺泡巨噬细胞极化的影响，未研究对M2型肺泡巨噬细胞极化的影响，仍需要我们不断深入去研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 陈健：实验操作, 研究设计, 论文撰写；周卫东、马金兰：数据收集及整理, 统计学分析；杨晓军、马立兵：研究设计, 论文修改
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