2024, Vol. 33
2. 新疆医科大学，乌鲁木齐 830054;
3. 新疆医学动物模型研究重点实验室，乌鲁木齐 830054
2. Xinjiang Medical University, Wulumuqi 830054, China;
3. Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Wulumuqi 830054, China
脓毒症是宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍[1]。全球于2017年约有4 890万人罹患脓毒症。尽管从1990-2017年，病死率下降了52.8%，但每年报告的脓毒症相关死亡人数仍占全球死亡人数的19.7%[2]。而在中国，翁利等[3]研究发现脓毒症相关死亡占2015年全国总死亡人数的12.6%。而肠道作为诱发脓毒症发病的初始器官[4]，在危重脓毒症模型中，肠上皮细胞凋亡的增加与病死率的增加有关[5]。而针对肠上皮细胞凋亡进行干预是提高脓毒症肠道损伤救治成功率的关键。
内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是除了线粒体途径和死亡受体途径以外的第三条细胞凋亡途径[6]。真核细胞中普遍存在内质网，对机体炎症反应和细胞凋亡有着重要作用[7]。肠上皮细胞具有发育良好的内质网结构，是代谢最活跃的细胞类型之一。持续和过度的ERS可以通过肠上皮细胞中的未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）从而引发炎症[8]。如果不能恢复内质网蛋白的稳态，UPR的激活可通过上调CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein antibody, CHOP）启动细胞凋亡。因此，缓解ERS介导的凋亡在脓毒症肠道损伤中显得尤为重要。
表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）作为绿茶儿茶素中最有效的活性成分，在绿茶儿茶素总量的占比约为59%[9]。EGCG作为抗氧化能力最强的一类儿茶素类化合物，其分子式为C22H18O11，EGCG的结构中包括8个酚羟基，EGCG极易提供出质子，进一步与自由基相结合而致自身被氧化为醌类，从而起到清除自由基的目的。相比自由基清除剂超氧化物歧化酶，EGCG功效要高出几倍至几十倍以上。抗氧化活性方面也至少是维生素C的100多倍[10]。作为水溶性多酚类化合物的EGCG，多种生物分子可与之结合，微摩尔甚至纳摩尔浓度水平即可调控信号转导途径以及相关酶活性[11]。已有实验表明EGCG在体外和体内对电离辐射诱导的肠上皮细胞死亡、肠道缺血-再灌注损伤、炎症性肠病等均具有保护作用[12]。本研究通过建立脓毒症肠道损伤大鼠模型，进而探讨EGCG是否可通过抑制ERS性凋亡来缓解脓毒症肠道损伤，为临床脓毒症所致肠道损伤的防治提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂选取8~12周龄健康雄性SD大鼠，共计60只，体重在180~220 g，由动物实验中心提供，动物合格证号：SYXK（新）2018-0003。EGCG购于美国Sigma-Aldrich公司；白介素（interleukin, IL）-1β、IL-6及肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司；一抗蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK）、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶（phosphorylated PERK, p-PERK）均购于美国Affinity Biosciences公司；一抗CHOP、紧密连接蛋白-1（CLDN1, Claudin-1）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12（cysteinyl aspartate specific protease-12, Caspase-12）、β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或抗鼠IgG二抗均购自美国Proteintech公司；免疫组织化学试剂盒购于福建迈新生物有限公司。
1.2 实验动物模型构建及分组将实验大鼠随机分为假手术组（Sham组）、盲肠结扎穿孔术致脓毒症组（cecal ligation and puncture，CLP组）、脓毒症+EGCG低剂量组（术后腹腔注射EGCG 25 mg/kg，EL组）、脓毒症+EGCG中剂量组（术后腹腔注射EGCG 50 mg/kg，EM组）、脓毒症+EGCG高剂量组（术后腹腔注射EGCG 75 mg/kg，EH组），每组12只。所有大鼠于室温18~24 ℃，相对湿度40%~60%环境下自由饮食水。脓毒症肠道损伤模型的制备采用CLP法。Sham组仅开腹暴露盲肠后立即关腹。EL组、EM组及EH组参照文献方法[12]于CLP术后经腹腔注射25、50、75 mg/kg的EGCG；在相同时间点给予Sham组和CLP组注射等体积生理盐水。5组大鼠均于术后24 h处死并取材。
本实验符合动物伦理学标准，并经伦理委员会的审批（审批号：IACUC-20220728-09）。
1.3 检测指标及方法 1.3.1 ELISA经大鼠腹主动脉采血5 mL，离心吸取上清液，严格根据ELISA试剂盒步骤检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
1.3.2 回肠组织病理学观察造模后24 h收集回肠组织，经中性多聚甲醛固定、经包埋、切片及苏木精伊红（hematoxylin-eosin staining, HE）染色，光镜下观察回肠组织病理学改变，严格按照Chiu's评分对回肠损伤情况进行评价。
1.3.3 蛋白质免疫印迹试验取50 mg肠道组织，蛋白定量采用二喹啉甲酸法，经电泳、转膜后用无蛋白快速封闭液封闭1 h，加入一抗Claudin-1（1∶4 000）、p-PERK（1∶500）、PERK（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000）、Caspase-12（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）于4 ℃冰箱摇床孵育过夜；次日室温下洗涤缓冲液洗膜后加入二抗，于室温摇床上避光孵育1 h后，经再次洗膜后滴加超敏增强型化学发光液曝光，目标蛋白的条带灰度值采用Image J软件进行分析，目标蛋白的相对量用β-actin为内参进行计算。
1.3.4 免疫组织化学取回肠组织经切片、脱蜡、水化、修复、阻断，血清封闭后分别加入Claudin-1（1∶500）、p-PERK（1∶100）、CHOP（1∶300）、Caspase-12（1∶100）抗体，4 ℃孵育过夜；经显色等流程后，在光镜下观察。用Image J软件进行半定量分析和计算。
1.4 统计学方法数据采用SPSS 26.0进行处理，统计图采用GraphPad Prism 9.0软件制作。计量资料均符合正态分布，采用均数±标准差（x±s）表示；多组间比较先进行方差齐性检验（Levene's test），方差齐采用单因素方差分析，方差不齐时采用Dunnett T3检验；进一步两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠血清中L-1β、IL-6及TNF-α表达水平CLP组大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明显高于Sham组（均P < 0.05）。EL组、EM组和EH组血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平较CLP组明显降低（均P < 0.05），且EM组上述炎症因子水平均较EL组降低（均P < 0.05），EH组上述炎症因子水平均较EM组进一步下降（均P < 0.05）。见表 1。
| 组别 | IL-1β | IL-6 | TNF-α |
| Sham组 | 11.72±2.03 | 10.60±4.94 | 19.27±2.09 |
| CLP组 | 148.71±10.10a | 165.00±10.29a | 165.22±7.37a |
| EL组 | 134.50±6.07ab | 142.54±11.45ab | 134.52±8.53ab |
| EM组 | 96.64±9.94abc | 105.55±18.13abc | 101.10±12.77abc |
| EH组 | 64.09±5.17abcd | 63.61±8.82abcd | 63.73±7.69abcd |
| F值 | 342.59 | 172.35 | 280.32 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 注：IL-1β为白细胞介素-1β，IL-6为白细胞介素-6，TNF-α为肿瘤坏死因子-α；与Sham组比较，aP < 0.05；与CLP组比较，bP < 0.05；与EL组比较，cP < 0.05；与EM组比较，dP < 0.05 | |||
大鼠造模后24 h，CLP组大鼠可见大量脱落的回肠上皮细胞、腺体结构严重破坏、可见较多炎性细胞聚集；Chiu's评分[13]明显高于Sham组[（4.83±0.41）分vs.（0.17±0.39）分，P < 0.05]。EL组、EM组及EH组回肠黏膜组织损伤程度对比CLP组均减轻；Chiu's评分均低于CLP组[（4.14±0.38）分、（3.22±0.44）分、（2.50±0.71）vs.（4.83±0.41）分，均P < 0.05]。见表 2，图 1。
| 分值 | 镜下肠道病理表现 |
| 0 | 正常肠黏膜及肠绒毛结构 |
| 1 | 通常在绒毛顶端黏膜下出现Gruenhagen′s间隙，伴毛细血管轻度扩张 |
| 2 | Gruenhagen′s间隙扩大，黏膜层上皮细胞轻度上抬 |
| 3 | 黏膜与黏膜下层分离，延伸至肠绒毛两侧 |
| 4 | 肠绒毛坏死脱落，固有层血管暴露 |
| 5 | 肠黏膜固有层崩解、出血或溃疡形成 |
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| Sham组回肠黏膜上皮完整，固有层结构清晰，绒毛排列整齐；CLP组回肠黏膜及其黏膜下间质存在严重水肿，可见绒毛排列紊乱、分布大量炎性细胞，绒毛结构破坏严重甚至脱落，大部分腺体结构严重破坏；EL组回肠黏膜、黏膜下间质水肿较重，可见绒毛排列较乱、较多炎性细胞浸润，部分绒毛结构杂乱，腺体结构破坏；EM组回肠黏膜及黏膜下间质水肿，绒毛排列较EL组规整，部分腺体结构不完整、绒毛结构破坏减轻；EH组回肠黏膜间质水肿明显减轻，绒毛排列整齐 图 1 光镜下观察各组大鼠回肠组织病理学变化（HE染色，×100） Fig 1 Histopathological changes in the ileum of rats in various groups observed under light Microscope (HE staining, ×100) |
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与Sham组相比，CLP组大鼠回肠组织中Claudin-1蛋白表达降低（P < 0.05）；p-PERK/PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达均增高（均P < 0.05）。EL组、EM组和EH组大鼠回肠组织中Claudin-1蛋白表达均较CLP组升高（均P < 0.05），且EM组回肠组织Claudin-1蛋白表达较EL组升高（P < 0.05）；EH组回肠组织Claudin-1蛋白表达较EM组进一步升高（P < 0.05）。EL组、EM组和EH组大鼠回肠组织中p-PERK/PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达均较CLP组明显降低（均P < 0.05），且EM组回肠组织p-PERK/PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达较EL组进一步降低（均P < 0.05）；EH组回肠组织p-PERK/PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达较EM组进一步降低（均P < 0.05）。见图 2。
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| Claudin-1为紧密连接蛋白-1, p-PERK为磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶，PERK为蛋白激酶R样内质网激酶，CHOP为CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白，Caspase-12为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12；与Sham组比较，aP < 0.05；与CLP组比较，bP < 0.05；与EL组比较，cP < 0.05；与EM组比较，dP < 0.05 图 2 回肠组织中Claudin-1蛋白以及PERK-CHOP-Caspase-12通路相关蛋白表达水平 Fig 2 Expression levels of Claudin-1 protein and PERK-CHOP-Caspase-12 pathway-related proteins in ileal tissues |
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免疫组织化学染色显示，Sham组Claudin-1表达强，回肠黏膜绒毛结构完整。与Sham组相比，CLP组Claudin-1表达极弱，细胞周围染色极少，回肠黏膜绒毛结构严重破坏（均P < 0.05）。EL组、EM组、EH组中Claudin-1表达均较CLP组显著升高，且EM组较EL组高，EH组较EM组更高（均P < 0.05）。见表 3，图 3。
| 组别 | Claudin-1 | P-PERK | CHOP | Caspase-12 |
| Sham组 | 26.07±2.57 | 0.79±0.08 | 1.67±1.00 | 1.76±0.14 |
| CLP组 | 1.37±0.16a | 11.93±3.17a | 23.54±6.47a | 23.14±1.50a |
| EL组 | 5.86±0.50ab | 7.79±1.61ab | 17.37±3.25ab | 16.68±1.14ab |
| EM组 | 14.61±0.64abc | 4.76±0.56abc | 11.64±1.51abc | 10.75±1.08abc |
| EH组 | 20.69±0.45abcd | 1.92±0.79abcd | 5.75±0.97abcd | 5.17±0.39abcd |
| F值 | 208.68 | 45.38 | 40.72 | 457.79 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 注：Claudin-1为肠道紧密连接蛋白-1，p-PERK为磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶，CHOP为CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白，Caspase-12为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12；与Sham组比较，aP < 0.05；与CLP组比较，bP < 0.05；与EL组比较，cP < 0.05；与EM组比较，dP < 0.05 | ||||
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| 棕黄色或黄褐色即为Claudin-1、p-PERK、CHOP、Caspase-12的阳性表达；Sham组中Claudin-1染色深表达强，而p-PERK、CHOP、Caspase-12染色浅表达弱；CLP组中Claudin-1染色浅，表达明显减弱，肠绒毛结构严重破坏，p-PERK、CHOP、Caspase-12呈黄褐色或棕褐色，表达强；EL组、EM组、EH组绒毛结构较为完整，Claudin-1染色较CLP组加深，p-PERK、CHOP、Caspase-12阳性染色较CLP组浅 图 3 光镜下观察各组大鼠回肠组织中Claudin-1、p-PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达情况（×200） Fig 3 Light microscopic observation of Claudin-1, p-PERK, CHOP, and Caspase-12 protein expression in ileal tissues of rats in each group (×200) |
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免疫组织化学染色显示，Sham组p-PERK、CHOP、Caspase-12表达极弱，细胞周围染色极少，回肠黏膜绒毛结构完整。与Sham组相比，CLP组p-PERK、CHOP、Caspase-12表达均增强，细胞周围染色增多，回肠黏膜绒毛结构严重破坏（均P < 0.05）。EL组、EM组、EH组中CHOP、p-PERK、Caspase-12表达均较CLP组显著降低，且EM组较EL组低，EH组较EM组更低（均P < 0.05）。见表 3、图 3。
3 讨论脓毒症的病理生理表现主要为感染性疾病诱发多器官功能障碍而致死亡的过程[14]。脓毒症患者即使在接受治疗后，其仍面临身体、心理以及认知方面的长期困扰，同时给患者和社会造成巨大的经济压力[15]。WHO已将脓毒症列为主要公共健康问题[16]。
脓毒症导致的肠道损伤进一步加剧了脓毒症的发展，最终导致严重感染，甚至死亡[17-18]。肠道作为保障机体内环境稳态的先天性屏障[19]，肠道屏障主要由三道防线组成：生物屏障，免疫屏障，机械屏障[20]。在生理状态下，肠上皮细胞的脱落和凋亡与增殖相互平衡，但在脓毒症情况下这种平衡将被打破，在脓毒症的患者及动物中均可发现肠上皮细胞凋亡及肠壁通透性的增加[21]。李杰等[22]研究发现EGCG通过保护肠道屏障和调节肠道菌群紊乱，从而对由葡聚糖硫酸钠导致的小鼠结肠炎症有改善作用。本研究显示，CLP组回肠黏膜组织中Claudin-1表达量对比Sham组明显减少，提示脓毒症时回肠黏膜组织中紧密连接蛋白结构遭受破坏；EL组、EM组及EH组Claudin-1表达量对比CLP组明显增加，表示EGCG可能通过减少回肠黏膜组织中紧密连接蛋白的破坏而达到肠道黏膜的保护作用。
明EGCG具有抗炎症、抗细菌、抗肿瘤、免疫调节等重要的生物学功能。EGCG通过破坏细胞膜、抗氧化活性、抑制脂肪酸合成、抗炎作用、抑制酶活性等达到抗细菌感染作用[23]。EGCG在脓毒症急性肝损伤中具有一定保护作用[24]。EGCG在肠道缺血-再灌注损伤、炎症性肠病等动物模型中通过多种调节机制发挥肠道黏膜屏障保护作用。与肠道缺血-再灌注损伤组相比，EGCG组IL-6、IL-1β、TNF-α明显减少[25-26]。本研究中给予低剂量、中剂量和高剂量EGCG干预后可有效减少脓毒症血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的相关表达，这与上述研究结果一致。
在脓毒症期间，随着内质网中逐步积累错误折叠或未折叠的蛋白，改变其稳态，导致氧化应激和严重的钙紊乱，从而引发ERS。PERK是位于内质网上的Ⅰ型跨细胞膜蛋白，随着UPR持续发生并继发ERS，首先在初期触发的是PERK信号通路。白藜芦醇苷抑制PERK/CHOP表达，从而减轻LPS诱导的脓毒症脑病引起的认知功能障碍。而真核生物翻译起始因子2α经活化的PERK调控发生磷酸化，一方面通过终止蛋白质合成，达到降低ER的负荷，另一方面通过上调转录激活子4（transcription factor 4, ATF4）的表达，ATF4作为CHOP的上游调控因子，可进一步活化CHOP，活化后的CHOP进一步激活ESR性凋亡反应的起始胱天蛋白酶-12进而介导细胞凋亡。在正常生理情况中，CHOP以极低水平普遍表达。但在微生物感染或病理条件时的ERS呈现压倒性的，CHOP表达急剧增加，细胞凋亡呈激活状态，各类细胞均可发生上述过程。研究发现脓毒症时小鼠免疫有关的细胞凋亡存在CHOP通路的参与[27]。本研究CLP组大鼠肠道组织中p-PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达均显著增高；EL组、EM组及EH组肠道组织中上述指标的表达均较CLP组明显降低，且EM组各指标的表达较EL组低；EH组各指标的表达较EM组进一步降低。p-PERK、CHOP、Caspase-12水平可显著升高，促进脓毒症大鼠肠黏膜细胞的凋亡，因此结合本研究结果和上述分析，推测EGCG可能是通过抑制ERS性凋亡以达到对大鼠脓毒症肠道损伤模型的保护作用，且作用呈剂量依赖性。
本研究尚存在以下限制。第一，不排除EGCG通过其他通路减轻肠道损伤; 第二，应进一步试验论证EGCG对肠道组织中细胞因子水平的作用。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 黄玮玮：实验操作、论文撰写；黄玮玮、马涛、李志华：数据收集及整理；王毅、高晓明、于湘友：研究设计、统计学分析、论文修改、经费支持
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