2024, Vol. 33
脓毒症是感染引起的器官功能障碍，可导致多器官功能障碍综合征[1]。肝脏是具有免疫、代谢、解毒等重要功能的器官，也是脓毒症早期易累及的器官之一[2]。脓毒症肝损伤的发生机制目前认为主要涉及肝脏能量代谢障碍、炎症因子与抗炎因子失衡、氧自由基和脂质过氧化等多个环节[3]。与脓毒症类似，目前对于脓毒症介导肝损伤的治疗方式以支持治疗为主，治疗效果差[4]。因此，探讨脓毒症肝损伤的发病机制，寻求有效的治疗方法具有重要意义。
小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的RNA，属于非编码RNA[5]。在脓毒症与肝损伤方面，已经有一些研究发现存在某些miRNA表达水平异常的证据，相关miRNA有望成为脓毒症急性肝损伤的治疗靶点[6]。有研究发现自身免疫性肝炎患者肝组织miR-155表达水平显著增加，其对募集炎症细胞与肝损伤具有重要的调节作用[7]。在脓毒症肝损伤方面，Wang等[8]发现在脓毒症小鼠模型中，其肝组织的miR-155表达水平显著上升，认为miR-155可能在脓毒症的发病过程中具有重要作用。因此，本研究试图进一步了解miR-155在损伤肝细胞中的机制研究。
片仔癀是我国的传统名贵中成药，具有清热解毒、活血化淤等功效。而对于其他类型的肝损伤治疗方面，片仔癀也显示一定的治疗作用。然而，片仔癀是否能够介导miR-155表达而缓解肝损伤，目前尚未见到相关报道。
1 材料与方法 1.1 主要试剂DMEM培养基（货号：11995）、LPS（货号：IL2020）购自购自北京索莱宝科技有限公司；片仔癀（漳州片仔癀药业股份有限公司，批号：1808087）；Lipofectamine 2000TM转染试剂盒（货号：11668030）、TRIzol试剂（货号：15596026）、细胞凋亡检测试剂盒（货号: 331200）均购自Thermo Fisher Scientific公司；PrimeScriptTMRT试剂盒（货号：RR047A）、SYBR®Premix Ex TapTMⅡ试剂盒（货号：DRR820A）购自TakaRa Bio公司；ELISA检测试剂盒IL-6（货号：D6050）、TNF-α（货号：DTA00D）和IL-10（货号：D1000B）均购自R&D公司。
1.2 主要仪器ABI7500实时荧光定量PCR仪（货号：4377354）购自Thermo Fisher Scientific公司；流式细胞检测仪（BriCyte E6，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；酶标仪（ELx808，Biotek，USA）；高速冷冻型微量台式离心机（D1524R，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司）；二氧化碳培养箱（D180，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。
1.3 细胞培养与处理肝脏Kupffer细胞（货号：HTX1973）购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，由本实验室传代培养。肝脏Kupffer细胞在含10% 胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，并置于潮湿的培养箱中（37℃，5%CO2）培养24 h后，吸弃上清液，更换培养液并加入1 mg/L的LPS进行细胞增殖诱导，继续培养12 h后加入片仔癀共培养。片仔癀处理的终浓度分别为0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L以及15 mg/L，处理时间为24 h。收集细胞进行后续实验。
1.4 细胞转染细胞转染所用的miR-155 inhibitor、miR-155 mimic及其各自对照均购自上海吉玛公司。根据制造商的说明，将所需质粒与LipofectamineTM 2000混合后转染到Kupffer细胞中，然后用LPS诱导Kupffer细胞12 h。其中miR-155 mimic及其对照组再用15 mg/L片仔癀处理LPS诱导的细胞24 h。收集细胞进行后续实验。
1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）用Trizol试剂提取细胞的总RNA。使用PrimeScriptTM RT试剂盒逆转录成cDNA。采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，使用SYBR®Premix Ex TapTMⅡ试剂盒，运用Applied Biosystems 7500HT系统进行PCR，并通过2-ΔΔCt方法分析数据。U6作为了miRNA的内参。所用引物由金唯智生物科技有限公司（北京，中国）合成。引物序列如下：miR-155正向：5'-TGCTAATCGTGATAGGGG-3'，反向：5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；U6正向：5'-GAACGCCTCATGATTTGCAGG-3'，反向：5'-AGAAGACTGAAACAGCACAGAGA-3'；IL-6正向：5'-TCTTGGGAC-TGATGCTGGTG-3'，反向：5'-CAGAATTGCCATTGCACAACTC-3'；IL-10正向：5'-AATTCCCTGGGTGAGAAGCTG-3'，反向：5'-TCATGGCCTTGTAGACACCTTG-3'；TNF-α正向：5'-GTAGCCCACGTCGTAGCAAA-3'，反向：5'-CCCTTCTCCAGCTGGGAGAC-3'；GAPDH正向：5'-GTTTGTGATGGGTGTGAACC-3'，反向：5'-TCTTCTGAGTGGCAGTGATG-3’。
1.6 Western Blot用RIPA裂解缓冲液从细胞中提取蛋白质。提取试剂盒（Beyotime，中国）说明书提取蛋白。然后，等量的蛋白质将样品加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳。将蛋白质转移到PVDF膜上，并用缓冲液中的5%脱脂奶粉封闭，然后与蛋白质的一抗在4℃下孵育过夜。然后用含有Tween 20 (TBST) 的Tris缓冲生理盐水洗涤膜，并与适当的辣根过氧化物酶缀合的二抗在室温下孵育1 h。进行化学发光检测蛋白质条带密度，并使用ImageJ软件进行定量。
1.7 流式细胞术使用Annexin V-FITC / PI细胞凋亡检测试剂盒，通过流式细胞检测仪分析细胞凋亡情况。收集5×105个细胞并用冷PBS洗涤两次，重悬于400 μL annexin V-fluorescein isothiocyanate（FITC）结合缓冲液中。然后，用5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（PI）对细胞进行染色，室温避光孵育15 min。流式细胞仪检测FITC和PI荧光，分析细胞凋亡率。
1.8 ELISA法各组细胞在4℃、12 000 r/min离心10 min，收集其上清液。通过ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-α和IL-10含量。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.9 统计学方法采用SPSS 22.0对数据进行统计学分析，所有实验独立重复三次，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。数据若服从正态分布及各组间满足方差齐性时，采用成组t检验或单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 片仔癀抑制损伤肝细胞中miR-155的表达LPS诱导Kupffer细胞后，miR-155的表达显著上升；不同浓度的片仔癀（0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L及15 mg/L）处理损伤的Kupffer细胞中miR-155的表达明显被抑制（F= 45.00，P < 0. 05）。图 1。
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| 与Control组比较，aP < 0.05，与LPS组比较，bP < 0.05 图 1 miR-155在各组细胞中的表达水平 Fig 1 Expression levels of miR-155 in cells in each group |
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LPS诱导的Kupffer细胞后，细胞培养基液上清液中促炎因子IL-6、TNF-α的表达水平显著增加，抗炎因子IL-10明显被抑制；用不同浓度的片仔癀处理损伤的Kupffer细胞，随着浓度片仔癀增加培养基上清液中炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平逐渐降低，抗炎因子IL-10的水平逐渐升高（F= 78.24，F= 550.83，F= 94.75；均P < 0. 05，图 2A）。IL-6、TNF-α、IL-10 mRNA及蛋白表达水平与之一致（F= 44.31，F=406.72，F= 81.68；及F= 63.12，F= 78.27，F= 6.13；均P < 0. 05，图 2B~D）。此外，LPS处理Kupffer细胞后，细胞凋亡率显著升高；用不同浓度的片仔癀处理损伤的Kupffer细胞，随着浓度片仔癀增加，细胞凋亡率逐渐降低，片仔癀治疗效果明显（F= 70.63；P < 0. 05，图 2E~F）。
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| 与Control组比较，aP < 0.05，与LPS组比较，bP < 0.05 图 2 各组细胞中IL-6、TNF-α和IL-10含量及凋亡率比较 Fig 2 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-10 contents and apoptosis rates in cells in each group |
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与inhibitor NC组比较，miR-155 inhibitor组中miR-155的表达水平明显降低（t=9.59，P < 0.05，图 3A）。沉默miR-155后，LPS处理的Kupffer细胞中培养基上清液促炎因子IL-6、TNF-α的表达水平明显降低，抗炎因子IL-10水平升高（t=6.94，t=5.78，t=4.84；P < 0.05，图 3B），IL-6、TNF-α、IL-10 mRNA及蛋白表达水平与之一致（t=4.97，t=5.94，t=6.93；及t= 6.01，t=8.65，t=9.26；均P < 0. 05，图 3C-E）。此外，细胞凋亡数目明显减少（t=5.31；P < 0.05，图 3F-G）。
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| 与LPS+inhibitor NC组比较，aP < 0.05 图 3 沉默miR-155抑制损伤肝细胞的IL-6, TNF-α和IL-10含量和细胞凋亡 Fig 3 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-10 contents and apoptosis rate in LPS-treated Kupffer cells after silencing miR-155 |
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转染miR-155 mimic组中miR-155的水平明显被升高（t=7.76，P < 0.01，图 4A）。转染mimic NC或miR-155 mimic后，然后用LPS诱导Kupffer细胞，再用15 mg/L的片仔癀处理诱导的细胞。与mimic NC组相比较，miR-155 mimic组促炎因子IL-6、TNF-α的含量增加，抗炎因子IL-10水平降低（t=6.73，t=5.53，t=5.50；P < 0.05，图 4B）。IL-6、TNF-α、IL-10 mRNA及蛋白表达水平与之一致（t=10.05，t=10.37，t=8.52；及t= 6.08，t=7.74，t=13.06；均P < 0. 05，图 4C-E）。此外，细胞凋亡率升高（t=6.21，P < 0. 05，图 4F-G）。
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| 与LPS+片仔癀+mimic NC组比较，aP < 0.05 图 4 过表达miR-155后，LPS处理Kupffer细胞中IL-6、TNF-α和IL-10含量及凋亡率比较 Fig 4 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-10 contents and apoptosis rate in LPS-treated Kupffer cells after overexpression of miR-155 |
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脓毒症是一种全身炎症，在严重的临床条件下会导致循环功能障碍或器官功能障碍[9]。其发病率和病死率相当高，严重脓毒症患者的病死率约为28%~50%[10]。脓毒症介导的急性肝损伤可发生在脓毒症的任何阶段，也是进展至多器官功能障碍综合征的重要标志[11]。早期的肝功能障碍是脓毒症患者死亡的一个重要危险因素，其重要性超过了传统的呼吸、循环、中枢神经系统等指标[12-13]。早期识别诊断脓毒症并予以有效的治疗，是提高患者生存率的关键[14]。本研究发现在LPS刺激肝脏Kupffer细胞损伤的模型中，miR-155的表达显著升高，炎症因子IL-6、和TNF-α的含量升高，抗炎因子IL-10表达降低，细胞凋亡增加。片仔癀处理后，抑制损伤肝细胞中miR-155的表达，抑制细胞炎症因子IL-6、和TNF-α的水平，促进抗炎因子IL-10的表达，抑制细胞凋亡。沉默miR-155可减轻细胞的炎症反应和凋亡率；过表达miR-155可逆转片仔癀治疗肝细胞损伤的作用。
研究发现，在酒精诱导的慢性肝损伤大鼠模型，复方片仔癀肝宝可通过提高肝组织的抗氧化能力而减轻肝损伤[15]。此外，片仔癀对脓毒症也有治疗作用。片仔癀可减轻内毒素所致的新西兰兔的发热反应，同时还能降低兔血清IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的水平，从而起到减轻炎症反应的作用[16]。本研究表明，片仔癀可以抑制Kupffer细胞损伤炎症因子IL-6、和TNF-α的表达，促进抗炎因子IL-10的分泌，抑制细胞凋亡。对损伤的肝细胞有明显的治疗作用。
miR-155参与了多种病理生理过程, 包括炎症、免疫和肿瘤发生等。在前期研究发现，脓毒症肝损伤动物模型肝组织miR-155表达水平显著上调，而靶向下调miR-155可通过多种机制治疗脓毒症肝损伤，包括：①抑制炎性细胞浸润、肝细胞坏死，抑制促炎细胞因子IL-6的产生，增加抗炎细胞因子IL-10的表达；②抑制脓毒症诱导的肝细胞凋亡；③增强Nrf2表达而抑制氧化应激。miR-155对氟代辛烷磺酸诱导的氧化性肝损伤的影响：氟代辛烷磺酸可显著增加miR-155的表达水平并同时抑制Nrf2/HO-1通路及其下游基因的表达，而抑制miR-155表达则可通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化应激作用。肝脏巨噬细胞Kupffer细胞作为机体固有免疫系统的重要成分，具有吞噬、抗原提呈和分泌细胞因子等功能，在脓毒症肝损伤中发挥重要作用。当病原体入侵机体时，肝脏Kupffer细胞可产生大量炎性因子如IL-6、TNF-ɑ而杀死入侵的病原体，并激活适应性免疫反应，但同时分泌的抑炎因子IL-10又可诱导Kupffer细胞凋亡，从而缓解炎症反应以避免正常组织细胞的损伤。本实验发现，在LPS刺激肝脏Kupffer细胞损伤的模型中，miR-155高表达，片仔癀处理损伤的肝细胞后，miR-155水平明显降低。沉默miR-155明显抑制损伤肝细胞的炎症反应和细胞凋亡。过表达miR-155明显减轻片仔癀治疗肝细胞损伤的作用，加重肝细胞损伤。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明-邱陆阵：研究的设计与实施指导、论文修订与审校、质量控制；杨钊斌：研究设计与实施、分析数据、论文撰写；何绍珍、黄道丰：统计分析；程小梅、陈惠萍：实验数据整理；夏浩：文献支持
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