缺血性脑病是临床上最为危重的疾病之一，会影响远期的大脑功能和导致神经系统后遗症［1］。多种原因所致的脑血流量过低或停止是此类疾病的基本因素，及时再灌注是治疗的关键，但在缺血-再灌注过程中，白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等炎性细胞因子会大量产生，并对脑细胞损伤中起着不可忽视的作用［2-3］。细胞因子需通过受体完成信号转导才能发挥效应，JAK家族和STAT家族是目前已知的主要细胞内信号蛋白。JAK激酶/信号转导和转录激活因子(Janus kinase/Signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)是多种细胞内的信号传导途径，JAK/STAT通路阻断剂可以削弱甚至阻断其信号的传导过程。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）之一的曲古抑素A（trichostatin-A，TSA）被认为是高效广谱的一类药物［4］，有实验证明TSA能减轻脑组织的损伤。TSA可能通过调控多个下游靶点来实现对脑细胞的保护，但具体机制仍不完全明确。本文利用大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤模型，主要研究TSA是否参与对JAK/STAT通路中JAK2和p-JAK2的调控发挥脑保护作用。

1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
仪器：全自动酶联免疫检测仪（Multiskan MK3， Thermo Fisher公司，美国），高速冷冻离心机（Centrifuge 5424R， Eppendorf公司，德国），IPP图象分析软件（Media Cybernetics公司，美国）；试剂：TTC（2.3.5-三苯基氯化四氮唑）（Sigma公司，美国）、TSA（Sigma公司，美国），Elisa试剂盒（武汉博斯迈生物科技有限公司，中国）等。
1.2实验动物
由浙江省中医药研究院实验室（实验动物的许可证号：SYXK（浙）2009-0122）提供的体质量200～250 g雄性清洁级Sprague Dawley(SD)笼养大鼠，每笼5只。
1.3实验方法
大鼠随机（随机数字法）分成I/R组（n=12）、假手术组（n=12）、TSA处理组（n=12）三组。I/R组按照改良大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤模型，0.30 mm线栓栓塞右侧大脑中动脉致缺血90 min后撤线再灌注；假手术组操作同I/R组，但不进行线栓栓塞；TSA处理组通过阴茎静脉注射TSA后20 min进行同I/R组操作，剂量0.05 mg/kg。
各组大鼠完成上述操作，继续再灌注24 h后予神经学评分，再处死大鼠，取出脑组织，切片观察，计算各组大鼠脑梗死体积百分比，继而将每组随机分成2小组（n=6），分别用于Elisa检测JAK2及p-JAK2蛋白的表达。
1.4神经功能与酶学指标的观察
1.4.1神经功能缺损评定  继续再灌注24 h后，先按照Longa等［5］分法对神经功能缺损的大鼠评分。标准为如下：0分：无神经缺损症状；1分：左前肢不能完全伸直；2分：向左旋转，提尾时向左侧转圈；3分：行走向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1~4分为有效模型。
1.4.2脑梗死体积统计  在冰桶中快速处死大鼠并取出脑组织，在-45 ℃冰箱中冷冻5～10 min，由额极向后冠状面切成2 mm厚的切片6片，置入1％TTC（2.3.5-三苯基氯化四氮唑）溶液，避光，37 ℃恒温水浴箱中孵育30 min，每隔5 min翻动TTC溶液中的脑组织切片；染色后，正常的脑组织表现为红色，梗死的脑组织表现为白色；以黑色纸版为背景，按照切片时的先后顺序排列脑组织切片，拍摄并保存图像，使用专业图像分析软件ipp 6.0处理、分析，得到脑梗死体积百分比数据。
1.4.3双抗体夹心法（ELISA法）（脑组织取出及切片同上述）将冰冻脑组织解冻，在置于冰上的研钵研磨后与生理盐水按照1∶10（0.15 g∶1.5 mL）配比成匀浆，严格按照说明书操作，测定各孔吸光（OD）值。
1.5统计学方法
通过SPSS 16.0处理并统计数据，方差分析神经功能缺损评分、梗死体积及JAK2蛋白检测数据，p-JAK2蛋白数据因方差不齐，采用非参数分析(Mann-Whitney U)进行统计，用均数±标准差（x±s）表示计量资料，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2  结果
2.1 神经功能缺损评分
假手术组无神经功能缺失症状，I/R组及TSA处理组均可见不同程度神经缺损；TSA处理组有神经缺损，但较I/R组明显减轻，组间差异具有统计学意义（P=0.019），见表1。

表1假手术组、I/R组、TSA处理组数据比较（x±s）
Table 1 The comparison of data in sham-operated group，ischemia/reperfusion(I/R) group and TSA group（x±s）
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指标 　　　　　　　　　　　假手术组　　　　　I/R组　　　　　TSA处理组　　　　　P值
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神经功能缺损评分（n=12）　　0　　　　　2.50±0.837　　　　　1.50±0.548　　　　0.019
脑梗死体积百分比（%,n=12）　0%　　　　13.989%±5.700%　　5.860%±1.501%　　　<0.01
JAK2蛋白OD值（n=6）　　　0.120±0.005　　0.106±0.013　　　0.107±0.187　　　　0.266
p-JAK2蛋白OD值（n=6）　　 2.416±1.643　　9.362±3.965　　　5.994±0.663　　　　0.009
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注：神经功能缺损评分、梗死体积百分比及JAK2蛋白OD值采用方差分析，p-JAK2蛋白OD值采用非参数分析作两两对比

2.2 大脑切片观察
2.2.1 TTC染色正常脑组织显示为红色，梗死灶显示为白色。
假手术组未见梗死灶；I/R组有明显梗死，白色区域范围较广；TSA处理组可见散在小面积的白色梗死灶，较I/R组减少（图1）。

A：假手术组TTC染色切片；B：I/R组TTC染色切片；C：TSA处理组TTC染色切片
图1三组大鼠脑组织TTC染色
Fig 1TTC staining of the brain tissue in three groups

2.2.2脑梗死体积比较 图像经分析软件ipp 6.0处理，得出假手术组梗死体积、I/R组梗死体积，TSA处理组梗死体积百分比数值，方差分析显示组间差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 JAK2蛋白和p-JAK2蛋白的表达
全自动酶联免疫检测仪检测脑组织中JAK2蛋白的含量，各组均有少量JAK2蛋白表达，以OD值作为数据统计，经方差分析，组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组OD值经非参数分析两两对比，I/R组与假手术组对照有明显上升(P=0.009)，TSA处理组与假手术组对照亦有明显上升(P=0.009)，TSA处理组与I/R组对照明显下降(P=0.009)，各组间差异具有统计学意义。

3 讨论
JAK/STAT通路是一条近年来新发现的信号转导途径，参与细胞的生长、活化、分化、凋亡及细胞相应功能的发挥等过程，是多种细胞因子信号转导的重要途径［6］。JAK是一类胞质内非受体型可溶性酪氨酸蛋白激酶家族，包括了4个成员，分别是JAK1、JAK2、TYK2和JAK3。JAK的下游底物，STAT蛋白家族可以接受JAK调控并与之结合的；另外，STAT蛋白可以直接被外界信号的刺激激活，作用于细胞核内相应靶基因并引发转录。通过JAK/STAT信号转导途径，细胞膜上感受的信号可以直接传递到核内并启动基因转录，作用直接而且传递速度快。STAT活化后与受体分离，形成同二聚体或异二聚体，转位至胞核并与结合至DNA上的特定调节序列，参与基因转录的调节［7］。目前已知，JAK/STAT途径承载了多种细胞因子的信号转导，如生长因子(表皮生长因子、血小板衍生长因子等)、干扰素-α、β、γ，白细胞介素-2、4、6，生长激素、瘦素等。因此通过该途径，可以从多个方面对基因及其表达进行调控［8］，如Fas、Fas-L、Bcl2与凋亡相关［9］，Mx蛋白和穿孔蛋白与免疫防御有关［10］，诱生型一氧化氮合酶、环氧合酶-2与缺血损害有关，血管紧张素原与循环有关［11］等等。
脑缺血后通过一系列的级联作用使STAT活化，继而对脑组织发挥损伤性作用，实质上为炎症级联反应, 这种反应以炎性细胞因子局部表达上调为特征［12］。Planas 等［13］报道，大脑皮质局部一过性缺血后，前24 h同侧皮质STAT1并未见明显表达增加，但从第4 d起STAT1表达显著增加，第7天达到峰值，可持续约15 d。大鼠脑缺血-再灌注模型中，Western印迹法在也可发现脑缺血处及其周边脑组织中的STAT1均有明显活化，再次灌注后同位置的STAT1活化更为显著。同时，STAT3的表达及活性也可因脑缺血时而改变。Justicia等［14］报道称，星型细胞内的STAT3在大脑皮质缺血后核转位，从而诱发了脑缺血后其胶质细胞的各种反应性变化。在对人脑皮质局部缺血-再灌注后的研究发现［15］，在缺血中心区和及其周围神经元可检测到大量磷酸化的STAT3表达，而在星型胶质细胞和小胶质细胞内却未见活化的STAT3表达。不仅脑缺血损伤通过JAK/STAT信号通路发挥损伤作用，多种其它类型神经系统损伤也可经此通路起作用。Lan KP 实验资料证实［16］，小鼠腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、白细胞介素-1后，可见其三叉神经节中的STAT1、STAT3表达增强，提示脓毒症的神经系统损伤的病理生理过程中不排除有STAT1、STAT3参与；扩展实验提示LPS有可能首先通过诱导白细胞介素-6表达增强，继而间接诱导STAT的表达。综合各方面实验报道，JAK/STAT信号通路与炎症的发生和发展有一定的相关性。通过药物对JAK/STAT信号通路的干涉，可能有助于抑制炎症的进展。
TSA是近年来发现的一种多靶向性药物，国内近些年对其在抗肿瘤方面的研究被较多探索，大量研究证明其能抑制多种肿瘤细胞的生长并有可逆转其耐药［17-18］。TSA在心脏、脑组织的保护的研究亦逐步增多。脑缺血性脑再灌注损伤的机制尚未完全清楚，炎症反应为缺血性脑损伤的重要病理机制之一，较多研究表明显示HDACi具有较强的抑制炎症因子生成作用。而TSA可能通过多条途径参与炎症介质的表达。
本实验本实验利用大鼠脑缺血-再灌注损伤模型来研究HDACi药物TSA对JAK/STAT信号通路的作用，通过大鼠神经学缺损评分、脑梗死观察、JAK2及p-JAK2的测定得出结果。实验表明，和I/R组比较，TSA处理组大鼠神经学评分降低，脑梗死范围减少，p-JAK2表达明显下降，但两组间JAK2表达差异没有明显的统计学意义。综上所述，JAK/STAT通路在脑组织缺血-再灌注损伤过程有着重要作用，脑组织损伤后，p-JAK2的表达增加，TSA可以有效降低p-JAK2的表达，提示TSA在小鼠脑缺血-再灌注损伤中的抑制作用可能与参与JAK/STAT通路的调节有关。该结论为临床研究TSA对脑缺血-再灌注损伤的干涉和治疗提供重要实验依据。当然，脑缺血-再灌注损伤是一系列复杂的炎症反应，而TSA也可能通过其它途径参与炎症介质的表达，其具体机制有待继续深入研究。

参考文献
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（收稿日期：2013-09-20）

———————以下内容为作者另行提供的附加图表，仅供读者参考，不作为正式刊出论文的部分。—————————

 
图1 左：评分2；右：评分3分。

图2 各组大鼠神经功能缺损评分对比图示

       假手术组                  I/R组                 TSA处理组
图3 各组脑切片梗死灶对比

图4 各组大鼠脑梗死面积百分比的对比图示

图5各组JAK2所得的OD值对比图示

图6 各组p-JAK2所得的OD值对比图示

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