目的：构建pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒，利用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）中，为构建实验性干预急性肺损伤的真核表达载体及转染原代培养AEC-Ⅱ提供方法学基础。方法：应用含人TGF-β1 CDS的质粒，设计PCR引物扩增出其CDS片段，将其与空质粒pEGFP-N1用XhoI和EcoRI双酶切，T4 DNA Ligase连接双酶切产物，将连接产物转化入DH5α中，培养16 h后抽提质粒，PCR法鉴定和测序证实TGF-β1 CDS序列正确。采用Lipofectamine 2000脂质体介导转染，将新生猪AEC-Ⅱ原代培养48 h至细胞融合80%~90%，换为无血清培养液；将质粒DNA（pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒）和Lipofectamine 2000加至DMEM培养液中混匀，置于培养箱中培养4~6 h，更换为完全培养液；转染24~48 h后，荧光显微镜下观察细胞EGFP表达水平。结果：PCR法及测序鉴定证实TGF-β1 CDS序列正确，重组质粒构建成功，采用Nanovue超微量分光光度计测浓度质粒浓度为195.5 μg/mL，转染后48 h在荧光显微镜下可见细胞有绿色荧光表达，证实已将其成功转染入原代培养的AEC-Ⅱ中。结论：成功构建了pEGFP-N1-TGF-β1真核表达载体，并首次采用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪AEC-Ⅱ中，为开展其他实验性干预ALI的基因转染并进一步研究其修复作用及转归提供方法学基础。

徐艳,孙波. 建立pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒和脂质体介导转染原代培养新生猪AEC-II方法探讨[J]. 中华急诊医学杂志, 2016,25(1): 50-56.
DOI号:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2016.01.012

基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81070057）

关键词： 肺泡Ⅱ型上皮细胞 原代培养 pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒 转染