2 南京医科大学附属无锡人民医院重症医学科 214023
2 Department of Critical Care Medicine, Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Wuxi 214023, China
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是以肺泡上皮细胞损伤为病理生理特点的急性难治性呼吸衰竭[1]。通过干细胞修复受损的肺泡上皮细胞是ARDS预后改善的希望所在[2]。间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是理想的组织修复种子细胞,动物研究证实外源性的MSC可以归巢并修复实验动物ARDS肺泡上皮损伤[3],但其修复效应受到MSC向ARDS肺组织归巢比例低、存留时间短等不利因素影响,因此寻找促进MSC分化、迁移、增殖和耐受损伤的机制有助于改善ARDS的预后[4]。
笔者既往体外研究提示抑制Hippo信号通路具备增强MSC向肺泡Ⅱ型上皮(alveolar type Ⅱ epithelial cell, ATⅡ)细胞分化迁移、增殖、向ARDS肺组织迁移及抗氧化应激损伤的强大效应,为优化ARDS的细胞治疗提供了新的突破口[5]。但由于在体实验微环境及调控机制更加复杂,因此对于Hippo信号通路是否能够在ARDS动物模型中增强MSC的肺保护效应尚缺乏有力证据[6]。本研究通过复制小鼠ARDS模型,并通过气道移植低表达大肿瘤抑制因子1(large tumor suppressor 1, LATS1)基因的MSCs细胞系,以明确抑制Hippo信号通路在体内环境中对MSC肺损伤修复能力的影响。
1 材料与方法 1.1 主要材料及试剂6~8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠144只, 体质量20~25 g,由北京军事医学科学院实验动物中心提供, 合格证号:SCXK(军)2015-0005]。脂多糖(LPS, Escherichia coli 0111:B4)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma-Aldrich公司)。C57BL/6小鼠骨髓来源MSC(mice bone marrow derived mesenchymal stem cells, mMSCs)细胞系(中国赛业生物技术公司)。10%胎牛血清(FBS)、DEMM/F12培养基(美国ThermoFisher公司)。胰蛋白酶(美国Gibco公司)。BCA蛋白定量试剂盒、RIPA细胞裂解液、核蛋白浆蛋白抽提试剂盒、过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (南京碧云天生物科技公司)。小鼠GFP抗体(美国Abcam公司)。兔SPC抗体、兔Occludin抗体、兔β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)。小鼠IL-1β、IL-6及IL-10的酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(美国BD公司)。小鼠总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技公司)。
1.2 mMSCs的转染和培养慢病毒转染C57BL/6小鼠mMSCs的步骤参考笔者此前发表的研究[6]。转染后的mMSCs使用含10 %FBS及1%链霉素和青霉素的DMEM/F12培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中进行传代培养,选取第6~7代细胞进行后续研究
1.3 小鼠LPS-ARDS模型的建立本研究动物实验方案符合美国实验动物管理与使用指南的要求。小鼠LPS-ARDS模型建立参照此前文献报道的方法[7]。小鼠以50 mg/kg的戊巴比妥腹腔注射麻醉后,以微量进液器直视下向气道内注入浓度2 mg/mL的LPS 50 μL建立LPS-ARDS模型,动物经面罩吸纯氧直至完全苏醒。
1.4 实验动物分组及处理将C57BL/6小鼠随机(随机数字法)分为4组(n=36):正常对照组、ARDS组、ARDS+空干扰病毒转染的mMSCs (MSC-shcontrol)治疗组、ARDS+转染干扰LATS1病毒的mMSCs(MSC-shLATS1)治疗组。正常对照组小鼠则向气道内注入与LPS等体积的50 μL生理盐水,4 h后再向气道内注入30 μL的PBS;ARDS组小鼠复制LPS-ARDS模型后4 h再向气道内注入30 μL的PBS;ARDS+MSC-shcontrol治疗组小鼠复制LPS-ARDS模型后4 h再向气道内注入含空干扰病毒转染mMSCs的PBS 30 μL(细胞数5×104);MSC-shLATS1组小鼠复制LPS-ARDS模型后4 h再向气道内注入含转染干扰LATS1病毒mMSCs的PBS 30 μL (细胞数5×104)。在建立LPS-ARDS模型后3、7、14 d处死小鼠,留取肺组织待检。
1.5 肺组织苏木精-伊红(HE)染色及肺损伤评分取右肺上叶组织以10 %中性甲醛固定,石蜡包埋横向连续切片行HE染色后,随机取10个高倍镜(400×)视野依据Smith方法行肺损伤半定量评分并取其平均数[8]。
1.6 肺组织改良Masson染色和肺纤维化评分取右肺下叶组织以10 %甲醛液固定,石蜡包埋横向连续切片行改良Masson染色后,随机取10个高倍镜(400×)视野依据Ashcroft评分方法行肺纤维化半定量评分并取其平均数[9]。
1.7 mMSCs的标记和追踪MSC-shcontrol和MSC-shLATS1使用NIR815标记,取标记细胞(细胞数5×105)分别直接注入LPS-ARDS小鼠的气道中。在成模后3、7、14 d处死小鼠取离体肺使用近红外成像系统追踪观察NIR815标记的mMSCs在小鼠肺内的存留(激发波长=786 nm,发射波长=814 nm,曝光时间4 000 ms),经颜色编码的荧光图像分析离体肺信号强度。
1.8 肺组织免疫荧光染色取左肺组织OCT包埋后-20 ℃切片后置于4℃丙酮中固定,室温风干后水化破膜,3 %BSA室温封闭后加入GFP和(或)SPC一抗4 ℃孵育过夜,PBS洗涤后加入荧光FITC/TRIT标记二抗室温孵育1 h,PBS洗涤后加入DAPI染色10 min,封片后荧光显微镜高倍镜(400×)下观察拍照记录,计数GFP阳性表达的绿色荧光细胞的数量。
1.9 Western blot检测蛋白表达水平采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒收集总蛋白及核蛋白,BCA法测定蛋白浓度,蛋白变性后按25 μL/孔上样,经SDS-PAGE电泳后转移至PVPD膜,5 %脱脂奶粉的TBST封闭1 h,一抗4 ℃孵育过夜,采用β-actin为内参蛋白,TBST冲洗3遍,加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h,TBST冲洗4遍,ECL试剂显色后X线片压片扫描,QuantityOne软件(美国Bio-Rad公司)定量分析条带的灰度值。
1.10 支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞因子及蛋白检测小鼠戊巴比妥腹腔麻醉后暴露颈前部气管后行气管插管,用1 mL冰PBS从气管内来回冲洗3次,收集灌洗液于4 ℃、3 000 r/min离心10 min,取上清液-80 ℃保存。依据ELISA试剂盒操作说明检测各样本IL-1β、IL-6、IL-10水平及总蛋白和白蛋白含量分别反映肺组织炎症水平和肺泡上皮通透性。
1.11 肺湿质量/体质量比和肺水肿检测取完整肺组织,小心修剪去除残存支气管和结缔组织,用吸水纸将肺组织表面水分吸尽并清除血污后,称重并计算肺湿质量/体质量比(LWW/BW),反映肺组织水肿和损伤程度。
1.12 统计学方法采用SPSS 20.0进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 低表达LATS1增加mMSCs在ARDS肺组织中的存留经颜色编码的荧光图像分析发现,MSC-shLATS1治疗组3、7、14 d小鼠离体肺图像信号明显高于MSC-shcontrol治疗组(P < 0.05),但其信号强度随着时间递减(图 1)。荧光显微镜检测发现MSC-shLATS1治疗组3、7、14 d小鼠肺组织内GFP阳性细胞数量明显高于MSC-shcontrol治疗组(P < 0.05),但其阳性细胞数随着时间递减(表 1、图 2)。
组别 | 3 d | 7 d | 14 d |
MSC-shcontrol治疗组 | 12.13±3.75 | 9.97±2.76 | 6.89±2.10 |
MSC-shLATS1治疗组 | 26.25±4.58a | 20.49±3.86a | 13.77±3.55a |
注:HP,高倍镜视野;与MSC-shcontrol治疗组相比,aP < 0.05 |
荧光显微镜下检测GFP阳性表达(绿色)及SPC阳性表达(红色)的细胞分别为mMSCs及ATⅡ细胞,双染阳性合并后呈黄色的细胞为mMSCs分化的ATⅡ细胞,结果发现MSC-shLATS1治疗组及MSC-shcontrol治疗组14 d小鼠肺组织内mMSCs及ATⅡ细胞数差异无统计学意义,但MSC-shLATS1治疗组14 d小鼠肺组织内mMSCs分化为ATⅡ细胞比例明显高于MSC-shcontrol治疗组(表 2、图 3)。Western blot检测发现MSC-shcontrol治疗组14 d小鼠ATⅡ细胞特异性标志物SPC蛋白水平表达显著高于ARDS组(P < 0.05);而MSC-shLATS1治疗组小鼠14 d SPC蛋白水平表达较MSC-shcontrol治疗组进一步增高(P < 0.05) (表 2、图 4)。
组别 | mMSCs分化为ATⅡ比例(%) | SPC蛋白表达 (相对于β-actin) |
正常对照组 | N/A | 0.89±0.22 |
ARDS组 | N/A | 0.27±0.08b |
MSC-shcontrol治疗组 | 19.64±3.71 | 0.51±0.12bc |
MSC-shLATS1治疗组 | 64.12±15.29a | 0.68±0.10abc |
注:N/A,未检测;与MSC-shcontrol治疗组比较,aP < 0.05;与正常对照组比较,bP < 0.05;与ARDS组比较,cP < 0.05 |
LWW/BW反映肺组织水肿程度。MSC-shcontrol治疗组3 d、14 d LWW/BW较ARDS组显著下降;MSC-shLATS1治疗组LWW/BW较MSC-shcontrol治疗组进一步下降(P < 0.05)(表 3)。BALF中总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)浓度反映肺上皮通透性。MSC-shcontrol治疗组3 d、14 d BALF中TP和ALB浓度较ARDS组显著下降;MSC-shLATS1治疗组BALF中TP和ALB水平较MSC-shcontrol治疗组进一步下降(P < 0.05)(表 3)。通过Western blot测定肺组织中上皮紧密连接蛋白Occludin的表达反映通透性。MSC-shcontrol治疗组14 d肺组织Occludin蛋白的表达较ARDS组显著上升;MSC-shLATS1治疗组14 d肺组织Occludin蛋白的表达较MSC-shcontrol治疗组进一步升高(P < 0.05)(图 5、表 3)。
组别 | LWW/BW(mg/g) | TP(mg/mL) | ALB(mg/mL) | Occludin蛋白表达 (相对于β-actin) |
|||||
3 d | 14 d | 3 d | 14 d | 3 d | 14 d | ||||
正常对照组 | 6.12±0.88 | 5.78±0.71 | 2.17±0.49 | 2.05±0.37 | 0.20±0.04 | 0.19±0.03 | 0.97±0.23 | ||
ARDS组 | 16.78±1.92a | 8.98±2.22a | 12.55±2.09a | 6.78±1.34a | 1.18±0.29a | 1.15±0.25a | 0.25±0.08a | ||
MSC-shcontrol治疗组 | 14.88±1.74a | 8.04±1.70a | 8.08±1.72ab | 5.94±1.20a | 0.71±0.21ab | 1.07±0.29a | 0.49±0.19ab | ||
MSC-shLATS1治疗组 | 9.85±1.51abc | 6.11±0.83abc | 5.12±0.87abc | 3.05±0.87abc | 0.44±0.18abc | 0.33±0.04abc | 0.79±0.11abc | ||
注:与正常对照组比较,aP < 0.05;与ARDS组比较,bP < 0.05;与MSC-shcontrol治疗组比较,cP < 0.05 |
ELISA法测定BALF中促炎症因子IL-1β、IL-6及抗炎因子IL-10的浓度反映肺部炎症。结果发现MSC-shcontrol治疗组BALF中IL-1β、IL-6浓度显著低于ARDS组,但IL-10浓度显著高于ARDS组(P < 0.05);而MSC-shLATS1治疗组BALF中IL-1β、IL-6浓度较MSC-shcontrol治疗组更低,但IL-10浓度较MSC-shcontrol治疗组更高(P < 0.05) (表 4)。
组别 | IL-1β(pg/mL) | IL-6(pg/mL) | IL-10(pg/mL) |
正常对照组 | 6.78±1.96 | 12.39±2.12 | 7.47±1.56 |
ARDS组 | 161.86±25.17a | 258.79±27.88a | 48.92±19.07a |
MSC-shcontrol治疗组 | 99.26±14.32ab | 145.54±13.29ab | 190.83±22.61ab |
MSC-shLATS1治疗组 | 60.11±8.58abc | 101.74±11.55abc | 316.65±37.88abc |
注:与正常对照组比较,aP < 0.05;与ARDS组比较,bP < 0.05;与MSC-shcontrol治疗组比较,cP < 0.05 |
与正常对照组相比,ARDS组小鼠肺组织存在广泛的肺泡及间质的水肿和出血,弥漫性的炎症细胞浸润,严重肺泡塌陷和肺泡结构破坏,其肺损伤评分亦显著增高(P < 0.05);而MSC-shcontrol治疗组3 d、14 d组织病理改变及肺损伤评分较ARDS组显著改善(P < 0.05);MSC-shLATS1治疗组组织病理改变及肺损伤评分较MSC-shcontrol治疗组进一步改善(P < 0.05) (表 5、图 6)。
组别 | 3 d-LIS | 14 d-LIS | 14 d-LFS |
正常对照组 | 1.01±0.22 | 1.14±0.31 | 0.28±0.03 |
ARDS组 | 12.59±2.83a | 7.92±1.49a | 2.02±0.39a |
MSC-shcontrol治疗 | 9.72±1.45ab | 5.11±0.86ab | 1.47±0.18ab |
组MSC-shLATS1治疗组 | 7.18±1.12abc | 3.33±0.49abc | 0.68±0.12abc |
注:LIS,肺损伤评分;LFS,肺纤维化评分;与正常对照组比较,aP < 0.05;与ARDS组比较,bP < 0.05;与MSC-shcontrol治疗组比较,cP < 0.05 |
肺组织改良Masson染色及肺纤维化评分可反映肺纤维化程度。结果显示ARDS组14 d肺泡间隔和肺泡腔内可见较明显的胶原纤维组织增生,肺泡壁明显增厚,部分肺泡结构消失,其肺纤维化评分亦较正常对照组显著增高(P < 0.05);而MSC-shcontrol治疗组肺组织仅见少量灶性及丝状的胶原纤维,其肺纤维化评分较ARDS组显著降低(P < 0.05);MSC-shLATS1治疗组几乎未见胶原纤维形成,其肺纤维化评分亦较MSC-shcontrol治疗组进一步下降(P < 0.05) (表 5、图 7)。
3 讨论肺泡上皮损伤是ARDS主要病理生理基础,损伤后残存的ATⅡ细胞可增殖并分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞修复肺损伤,但中重度ARDS时ATⅡ细胞破坏严重,其数量不足以修复受损的肺泡上皮,此时补充外源性修复种子细胞是可行的选择[10]。MSC是来源于中胚层的具备多向分化潜能的干细胞,前期研究表明ARDS动物模型中给予外源性MSC确实能够修复受损肺泡上皮甚至降低其病死率,但如何解决MSC向肺脏归巢数量少,肺内存留时间短及分化比例偏低等问题,仍是ARDS细胞治疗面临的难题[11]。此前研究表明,在体外试验中通过低表达其关键信号分子LATS1抑制Hippo信号通路活化有助于增强MSC向ATⅡ的分化、增殖和向ARDS肺脏的归巢[12],有望进一步提高MSC的肺保护效应,本研究通过在体动物实验予以验证。
本研究发现低表达LATS1可增加mMSCs在ARDS肺组织中的存留。外源性MSC进入体内后可向损伤和炎症部位聚集,这是其发挥组织修复等功能的前提。既往研究已经证实动物模型中MSC向ARDS肺组织归巢的数量明显高于正常肺组织,如Xu等[13]发现移植到小鼠ARDS模型中的MSC向肺组织归巢的数量明显多于正常小鼠。目前调控MSC向损伤部位迁移的分子机制尚无定论,有研究表明转化生长因子β1, IL-1β, TNF-α,干细胞来源因子-1α,趋化因子受体CXCR4均可能加强其归巢作用[14-15]。而本研究证明Hippo信号通路在体内能够调节MSC的迁移和归巢,为MSC迁移和归巢调控机制提供了新的视点。
本研究发现低表达LATS1可增加mMSCs向ATⅡ细胞的分化。目前对于Hippo信号通路调控MSC分化的作用仍缺乏定论,如Tang等[16]研究发现在成肌诱导培养环境中活化mMSCs的Hippo信号可促进其向成肌纤维细胞的分化;但Chen等[17]在成骨诱导培养环境中研究发现活化mMSCs的Hippo信号反而抑制其向成骨细胞的分化。由此可见对于不同的诱导分化细胞类型,甚至同一种细胞在不同的环境和时点,Hippo信号通路对MSC所起的调节作用可能不尽相同,这种差异可能来自于细胞所处微环境、分化细胞类型的不同[18]。
本研究发现低表达LATS1的mMSCs可分化为肺泡上皮细胞并加强肺泡上皮紧密连接,这可能是低表达LATS1的mMSCs改善ARDS肺组织水肿及通透性的潜在机制[19]。已有研究也得到相似结果,如Pati等[20]在失血性休克相关肺损伤中发现给予外源性MSC可通过保护肺血管内皮紧密连接改善内皮通透性和肺水肿。本研究通过抑制Hippo通路可进一步加强MSC对肺泡上皮屏障的保护作用。
本研究发现低表达LATS1的mMSCs可降低肺组织抗炎因子IL-1β、IL-6的水平而增加抗炎因子IL-10的产生,从而改善肺内促炎/抗炎反应失衡[21]。这也与既往研究相似,如Zhu等[22]研究表明给予外源性MSC有助于减少小鼠ARDS模型肺组织IL-6的分泌,同时也可增加IL-10的分泌。本研究通过抑制Hippo通路可进一步加强MSC对ARDS肺部炎症的调控作用。
本研究发现低表达LATS1的mMSCs可改善ARDS肺组织病理损伤及减少纤维化病变,从而有可能降低ARDS病死率及改善其远期预后。肺组织病理是ARDS诊断、疗效和预后评判的金标准,而肺损伤修复过程中胶原纤维增生导致的肺纤维化可直接影响ARDS患者远期肺功能和生活质量[23]。这也与既往研究相似,如Devaney等[24]研究表明气道内给予MSC有助于改善大鼠ARDS模型病理损伤,而陈敏等[25]研究发现气道给予MSC可显著减少大鼠百草枯中毒模型肺纤维化程度。本研究通过抑制Hippo通路可进一步加强MSC对ARDS肺病理损伤和肺纤维化的疗效。
综上所述,本研究发现在小鼠LPS-ARDS模型中移植低表达LATS1基因的mMSCs可促进其向肺组织的归巢和向ATⅡ细胞的分化,改善肺水肿及肺内炎症,减轻肺损伤和肺纤维化病变。抑制Hippo信号通路可能有助于增强mMSCs对ARDS的修复效应,但仍有待于进一步研究证实。
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